Una técnica de tinción de inmunofluorescencia para detectar la neurogénesis del hipocampo adulto

Resumen

Fuente: Ansorg, A., et al. Inmunohistoquímica y marcaje múltiple con anticuerpos de la misma especie huésped para estudiar la neurogénesis del hipocampo adulto. J. Vis. Exp. (2015)

El video ilustra un método de tinción de inmunofluorescencia utilizado para examinar la neurogénesis en el hipocampo adulto. Inicialmente, una sección del cerebro de un ratón se somete a un tratamiento con anticuerpos primarios dirigidos a las proteínas marcadoras asociadas con la neurogénesis en las células progenitoras neuronales. A continuación, se marca con anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos. A continuación, se observa la sección del cerebro bajo un microscopio confocal para distinguir varios subtipos de células progenitoras, basándose en los patrones de expresión de distintas combinaciones de proteínas marcadoras.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Preparación de tejidos

1. Preparar formaldehído al 4% en tampón de fosfato 0,1 M pH 7,4 el día antes de la perfusión. Conservar a 4 °C.
2. Perfundir por vía transcardíaca a los ratones profundamente anestesiados (isoflurano al 3,5%) a través del ventrículo izquierdo con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato helado (PBS), luego con 40 ml de formaldehído helado (caudal de 5 ml/min). Diseccionar el cerebro y colocarlo en el mismo fijador durante 24 horas a 4 °C.
3. Transfiera los cerebros consecutivamente a 10% (24 horas a 4 °C) y 30% de sacarosa (hasta que el cerebro se hunda, aprox. 48 horas). Para la congelación, sumerja lentamente los cerebros crioprotegidos en isopentano a -25 °C hasta que no emerjan burbujas del tejido. Conservar a -80 °C.
4. Corte secciones coronales de 40 μm de espesor en un micrótomo de congelación (temperatura de bloque de -25 a -16 °C). Transfiera secuencialmente las secciones a una solución anticongelante que contenga pocillos de una placa de cultivo celular de 24 pocillos (consulte la Figura 1). Conservar a -20 °C.

>2. Inmunotinción

>NOTA: Las secciones se procesan flotando libremente, generalmente en placas de 6 pocillos equipadas con una placa portadora e insertos de malla. Como excepción, el bloqueo, las incubaciones de anticuerpos y las reacciones del complejo avidina-biotina (ABC) se realizan en placas de 12 o 24 pocillos sin insertos de malla (de 0,5 a 1 ml por pocillo es suficiente, dependiendo del número de cortes que se deban teñir). Durante estos pasos, transfiera las secciones con la ayuda de un cepillo fino (enjuague con cada nueva solución). Todas las incubaciones se realizan con agitación continua (máx. 150 rpm).

1. Inmunohistoquímica (método ABC)
   1. Transfiera las secciones del anticongelante a solución salina tamponada (TBS) y enjuague bien (una vez O/N a 4 °C, 5 veces a temperatura ambiente [RT] durante 10 minutos cada una) para eliminar completamente el anticongelante.
   2. Para apagar la actividad de la peroxidasa endógena, incubar durante 30 min en 1,5% H₂O₂ en TBS-Tween 20 (TBS-T). Preste atención a las secciones burbujeantes y vuelva a sumergirlas si es necesario. Enjuague 3 veces en TBS durante 15 minutos cada una.
   3. Opcional: Mientras tanto, precaliente un armario calefactor y 2 N HCl a 37 °C. Para desnaturalizar el ADN, incubar las secciones durante 30 min a 37 °C en HCl 2 N. Separa suavemente las secciones con la ayuda de un cepillo.
   4. Opcional: Neutralizar secciones durante 10 min en tampón de borato de 0,1 M pH 8,5, RT. Durante la transferencia, frote brevemente los insertos de malla que contienen las secciones en una toalla de papel para eliminar los restos de HCl. Enjuague 2 veces en TBS durante 15 minutos cada una.
   5. Incubar en TBSplus para permeabilizar el tejido y bloquear los sitios de unión de anticuerpos inespecíficos durante 1 hora en RT.
   6. Incubar en anticuerpo primario diluido en TBSplus, O/N a 4 °C. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 min cada una.
   7. Incubar en anticuerpo secundario biotinilado diluido en TBSplus durante 3 horas en RT. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 min cada una. Mientras tanto...
   8. Prepare el complejo ABC de acuerdo con el protocolo del fabricante (1% A + 1% B en TBS-T). Deje reposar durante 30 minutos a RT antes de usar. Incubar las secciones en el reactivo AB durante 1 hora en RT. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 min cada una.
   9. Prepare 50 ml de 0,5 mg/ml de 3,3′-diaminobenzidina (DAB) en TBS-T por placa de 6 o 12 pocillos, dividida en dos mitades, y pipetee 4 ml o 2 ml por pocillo, respectivamente. Transfiera las secciones a la solución DAB (¡ATENCIÓN! El DAB es tóxico. Siga la MSDS específica proporcionada por el proveedor, es decir, use una bata de laboratorio y guantes y use una campana de gases químicos).
   10. Añada 0,5 ml de H₂O₂ al 1% al resto de los 25 ml de solución de DAB, mezcle y pipetee los volúmenes equivalentes indicados anteriormente en cada pocillo para iniciar la reacción de peroxidasa. Incubar durante 12 min. Enjuague 3 veces en TBS durante 15 minutos cada una.
   11. Monte las secciones a los portaobjetos en gelatina y séquelas al aire O/N. Cubreobjetos con medio de montaje permanente.
   12. Opcional: Contramancha antes de colocar el cubreobjetos.
       nota: Si la relación señal/ruido es baja debido al alto fondo, repita el tratamiento H₂O₂ después de la incubación con el reactivo AB (paso 2.1.8).
2. Inmunofluorescencia múltiple
   1. Inmunofluorescencia múltiple simple o simultánea
      1. Transfiera las secciones del anticongelante al TBS y enjuague bien (una vez O/N a 4 °C, 5 veces a RT durante 10 minutos cada una) para eliminar el anticongelante por completo.
      2. Opcional: como pasos 2.1.3 - 2.1.4.
      3. Incubar en TBSplus para permeabilizar el tejido y bloquear los sitios de unión de anticuerpos inespecíficos, 1 hora a RT.
      4. Incubar en cóctel de anticuerpos primarios (p. ej., α-BrdU de rata (bromodeoxiuridina), conejillo de indias α-DCX (doble cortina), α-GFP de cabra (proteína fluorescente verde)) diluido en TBSplus, O/N a 4 °C. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada una.
      5. Incubar en un cóctel de anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo (por ejemplo, Rhodamine Red α rata, Alexa-647 α cobaya, Alexa-488 α cabra; todos derivados en burro) diluidos en TBSplus, 3 horas a RT o O/N a 4 °C. A partir de ahora, proteja las secciones de la luz. Enjuague 3 veces en TBS durante 15 minutos cada una.
      6. Monte las secciones en portaobjetos en gelatina y séquelas al aire durante la noche (O/N). Cubreobjetos con medio de montaje acuoso.
   2. Inmunofluorescencia múltiple secuencial con anticuerpos primarios de la misma especie huésped
      1. Como pasos 2.2.1.1 - 2.2.1.3.
      2. Incubar en el primer anticuerpo primario (p. ej., antígeno A α de conejo), O/N a 4 °C. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 min cada una.
      3. Incubar en el primer anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo (p. ej., Rhodamine Red-conj. burro α-conejo), RT de 3 horas. A partir de ahora, proteja las secciones de la luz. Enjuague 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada una.
      4. Incubar en suero normal al 10% del mismo huésped que los anticuerpos primarios (p. ej., suero de conejo) durante 3 horas de RT para saturar los parátopos abiertos en el primer anticuerpo secundario. Enjuague 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada una.
      5. Incubar en TBSplus con 50 μg/ml de fragmentos Fab monovalentes no conjugados dirigidos contra el huésped de los anticuerpos primarios (p. ej., IgG de conejo α (H+L)) para cubrir los epítopos que podrían ser reconocidos por el segundo anticuerpo secundario, O/N a 4 °C.
      6. Enjuague al menos 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada una. Durante la transferencia, frote brevemente los insertos de malla que contienen las secciones en una toalla de papel para eliminar los restos de Fab.
      7. Incubar en un segundo anticuerpo primario (p. ej., α-antígeno B de conejo), O/N a 4 °C. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 min cada una.
      8. Incubar en un segundo anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo (p. ej., Alexa-488-conj. burro α-conejo), 3 horas RT. Enjuague 3 veces en TBS durante 15 minutos cada una, monte y cubra el deslizamiento como se indica arriba.
         nota: Para marcar antígenos con anticuerpos de diferentes especies de hospedadores, agréguelos al paso 2.2.2.2 y los anticuerpos secundarios respectivos al paso 2.2.2.3.

Resultados

Figura 1. Ilustración esquemática de la transferencia de rebanadas de micrótomo a una placa de 24 pocillos. Comience en A1 y coloque las rebanadas subsiguientes en la fila A; después de A6, vaya a la siguiente fila B, y así sucesivamente. Al llegar a D6, vuelve a A1 y continúa. Esta disposición de los cortes permite la cuantificación de cada n^ésima sección de un cerebro completo. Para la c...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Preparación de tejidos
Isoflurano-Actavis	Piramal Cuidado de la Salud	700211
Paraformaldehído en polvo (PFA)	Riedel-de Häen	Año 16005	tóxico, inflamable
bomba de perfusión PD5206	Instrumentos Heidolph	523-52060-00
Tubo de laboratorio Masterflex Tygon, Ø 0,8 mm	Thermo Fischer Scientific	06409-13
Aguja de alimentación, recta, 21 G, 1,75 mm punta de aceituna, 40 mm	Agnthos	Año 1036
micrótomo de congelación Microm HM 400	Thermo Fischer Scientific
Placas multipocillos de cultivo celular de 24 pocillos	Greiner Bio-One	662160
Inmunohistoquímica
Vaporera Tefal vitacuisine	Tefal	VS 4001
Inserciones de membrana de malla de poliéster Netwell de 24 mm	Corning	3479	Precargado en placas de cultivo de 6 pocillos
Inserciones de membrana de malla de poliéster Netwell de 15 mm	Corning	3477	Precargado en placas de cultivo de 12 pocillos
Kit de soporte de plástico Netwell para 6 pocillos	Corning	3521	para inserciones de membrana de malla de poliéster de 24 mm
Kit de soporte de plástico Netwell para 12 pocillos	Corning	3520	para inserciones de membrana de malla de poliéster de 15 mm
Kit Vectastain Elite ABC	Laboratorios de vectores	PK-6100
DAB (hidrato de tetraclorhidrato de 3,3′-diaminobenzidina)	Sigma-Aldrich	D-5637	cancerígeno, sensible a la luz
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Anticuerpos primarios
conejo IgG1 α-Ki67
conejo α-GFAP, AS-3-GF	Novocastra/ Leica Biosystems	NCL-L-KI67MM1	DAB 1:400/IF 1:100; requiere recuperación de epítopos
IgG (H+L) de cabra α-GFP	Sistemas sinápticos	173 002	09:20
ratón IgG1 α-nestin	Anticuerpos Acris	R1091P	06:00
cobaya IgG (H+L) α-Doublecortin	Abcam	AB6142	1:200; requiere recuperación de epítopos
rata IgG2a α-BrdU (ascitis)	Merck Millipore	AB2253	09:20
rata IgG2a α-BrdU (purificada)	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030CX	para la detección de BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
ratón IgG1κ α-BrdU	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030	para la detección de CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
ratón IgG1 α-NeuN	BD Biociencias	347580	para la detección de IdU; DAB 1:500/IF 1:350
Anticuerpos secundarios	Merck Millipore	MAB377	09:20
burro α-cobaya IgG (H+L)-Biotina
burro α-rata IgG (H+L)-Biotina	Dianova	711-065-152	09:20
burro α-ratón IgG (H+L)-Biotina	Dianova	712-065-150	09:20
cabra α-rata IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Dianova	715-065-151	09:20
burro α cabra IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Sondas moleculares	A11006	05:10
burro α-ratón IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment	Sondas moleculares	A11055	05:10
burro α-ratón IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	715-097-003	02:40
burro α cobaya IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	715-605-151	05:10
burro α-rata IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova	706-605-148	05:10
burro α-conejo IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova	712-295-150	05:10
burro α-cobaya IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova	711-295-152	05:10
Estreptavidina-Rodamina Rojo-X	Dianova	706-296-148	05:10
cabra α-conejo IgG (H+L)-AMCA	Dianova	016-290-084	09:20
Hoechst 33342	Dianova	Números 111-155-144	1:250, funciona solo con conejo α-GFAP
DAPI	Sondas moleculares	H3570	17:40
bloqueante	Sondas moleculares	D1306	17:40
Fragmento fabuloso de burro α ratón IgG (H+L)
Fab-fragmento de burro α-conejo IgG (H+L)	Dianova	715-007-003	01:20
Suero de burro normal	Dianova	711-007-003	01:20
Suero de conejo normal	Merck Millipore	S30
Suero de cabra normal	Dianova	011-000-010
Albúmina sérica bovina	Dianova	005-000-001
histología	Sigma-Aldrich	A7906
Cresyl violeta
Neo-Claro	Sigma-Aldrich	C5042
Neo-Montura	Merck Millipore	109843	sustituto de xileno no tóxico
microscopia	Merck Millipore	109016	medio de montaje permanente
Axioskop 2
LSM 710	Microscopía Carl Zeiss
	Microscopía Carl Zeiss