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1. Preparación animal
- Anestesiar a los ratones con isoflurano al 3%. Abra el tórax haciendo una incisión horizontal en la región por encima de la parte media del abdomen y tirando de la piel. Con cuidado, haga otra incisión para abrir la cavidad torácica sin perforar ningún otro órgano.
- Perfundir el corazón a través del ápex primero y luego el ventrículo derecho utilizando glutaraldehído frío al 3% en solución cardiopléjica (50 mM de KCl, 5% de dextrosa en PBS, ver Tabla 1) durante 2 min para asegurar una relajación miocárdica completa.
- Perfunda el corazón con glutaraldehído al 3% helado en 0,1 M de tampón de cacodilato de sodio (pH 7,4) durante otros 2 min. Usando presión de gravedad, use una aguja de 25 G 5/8" para introducir los fijadores en el corazón. Inmediatamente después de que el corazón comience a llenarse con el fijador, levante el ápice del corazón y corte los vasos por debajo a 1-2 mm del corazón para aliviar la presión y permitir que los líquidos drenen.
- Diseccione el corazón, extraiga las aurículas y coloque los ventrículos en un cacodilato de sodio al 3 % y 0,1 M en una placa de Petri. Haga un corte de mariposa después de 30-60 minutos de fijación y colóquelo en una placa de Petri que contenga un 3% de glutaraldehído/cacodilato (consulte la tabla de materiales). Picar el corazón con una cuchilla quirúrgica en cubos pequeños de 1mm3 mientras está en solución de glutaraldehído/cacodilato.
- Fijar/sumergir el tejido cardíaco disecado en una solución de glutaraldehído/cacodilato durante 24 h a 4 °C.
2. Procesamiento del tejido cardíaco
- Después de 24 h de fijación, lavar los tejidos con 0,1 M de tampón de cacodilato de sodio durante 20 min.
- Prepare el tampón de cacodilato de 0,1 M siguiendo los pasos que se indican a continuación.
- Para preparar tampón de cacodilato de sodio 0,1 M, prepare un stock de tampón de cacodilato de sodio 1 M disolviendo cacodilato de sodio (21,4 g) y una solución de cloruro de calcio al 1% (3 mL) en 90 mL de agua destilada. Aumente el volumen de la solución a 100 ml agregando el agua destilada. Revuelve bien la solución y déjala toda la noche para que disuelva el soluto.
- A continuación, tome 10 mL de solución madre de cacodilato de sodio 1 M y agréguela a 80 mL de agua destilada. Ajuste el pH a 7.4 usando HCl y póltelo hasta 100 mL agregando agua destilada.
- Repita el lavado en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M durante otros 20 min. Retire los tejidos del tampón de cacodilato de sodio y sumérjalos en una solución de tetróxido de osmio al 2% durante 4 h a temperatura ambiente. Este proceso se denomina osmicación.
- Prepare la solución de tetróxido de osmio al 2% siguiendo los pasos a continuación.
- Para preparar una solución de tetróxido de osmio al 2%, tome una solución de tetróxido de osmio al 4%, 4 mL (ver Tabla de Materiales), 1 M de solución madre de cacodilato de sodio (0.8 mL) y agua destilada (3.2 mL) para hacer un total de 8 mL de solución><.
nota: Todo este proceso y los pasos a partir de ahora deben llevarse a cabo en la campana extractora.
- Después de la osmicación, sumerja los tejidos en una solución de acetato de sodio al 2% durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Prepare la solución de acetato de sodio al 2% disolviendo 4 g de acetato de sodio en 20 mL de agua destilada.
- A continuación, sumerja los tejidos en una solución de acetato de uranilo al 2% durante 1 h a temperatura ambiente.
- Prepare la solución de acetato de uranilo al 2% disolviendo 4 g de acetato de uranilo en 20 ml de agua destilada.
- Después de la tinción con acetato de uranilo, deshidratar los tejidos secuencialmente a través de los alcoholes graduados y la acetona en el orden mencionado en la Tabla 2.
>3. Incrustación de tejido cardíaco
- Incruste los tejidos deshidratados en resina epoxi de baja viscosidad siguiendo los pasos a continuación.
- Para hacer resina epoxi de baja viscosidad, mezcle 10,24 mL de monómero epoxi de dióxido de ciclohexeno de vinilo, 6,74 mL de éter diglicidílico de polipropilenglicol (DER 732) y 30,05 mL de anhídrido succínico de nonenilo (NSA) (consulte la Tabla de materiales) en un tubo de 50 mL. Revuelva bien la suspensión con la mano durante 2 min.
- Agregue 18 gotas de acelerador epoxi de 2-dimetilaminoetanol (DMAE, consulte la tabla de materiales) y revuelva la suspensión para mezclar bien los componentes.
- Impregnar los tejidos en resina epoxi en la siguiente secuencia de mezcla.
- Sustituye la suspensión de acetona 100% acetona por resina 1:1 y sumerge los tejidos en ella durante 1 h a temperatura ambiente.
- Sustituya la resina 1:1: suspensión de acetona por resina 6:1: suspensión de acetona y sumerja los tejidos en ella durante 3 h.
- Por último, sustituye la suspensión de resina: acetona 6:1 por una suspensión 100% resina y deja los tejidos sumergidos en ella toda la noche a temperatura ambiente.
- Coloque los tejidos en resina fresca en micromoldes de 8 mm (consulte la Tabla de materiales) y cure los tejidos incrustados a 70 °C durante la noche.
nota: Asegúrese de que la resina sea dura pero no quebradiza después del curado.
>4. Seccionamiento de tejidos con un ultramicrótomo
- Recorte los bloques de resina con el tejido a no más de 1 mm antes de montarlos en el ultramicrótomo (consulte la tabla de materiales). Coloque el molde con la mayor precisión posible en el brazo segmentado del ultramicrótomo y avance manualmente el molde de muestra hacia el cuchillo de diamante.
- Corta las secciones a un grosor de 500 nm (media micra) con un cuchillo Histo (ver Tabla de Materiales), y usando la herramienta EM loop, recógelas y colócalas en un portaobjetos de vidrio.
- Coloque el portaobjetos de vidrio en una placa caliente para la tinción de azul de toluidina para encontrar el área de interés.
- Después de encontrar el área de interés, use un cuchillo Ultra 45° (consulte la Tabla de materiales) para producir secciones ultrafinas de oro pálido (100 nm). Coloque estas secciones ultradelgadas en el lado opaco de una rejilla de cobre de malla 200.
>5. Tinción ultrafina de la sección del corazón
- Comience la tinción desenmascarando el antígeno con una solución de grabado, es decir, una solución de metaperiodato de sodio al 5%.
- Prepare 500 μL de solución de metaperiodato de sodio al 5% (ver Tabla de Materiales) en agua destilada.
nota: Prepare la solución fresca antes de usarla.
- Coloque 20 μL de solución de metaperiodato de sodio sobre una película de parafina limpia. Coloque las rejillas completamente secas con secciones de tejido sobre la gota de la solución de grabado.
nota: El lado opaco de la rejilla con la sección de tejido debe mirar hacia la solución de grabado.
- Deje la rejilla de secciones en la solución durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Lave la sección de tejido grabado colocándola sobre una gota de agua destilada durante 60 s.
- Bloquee los aldehídos residuales colocando las rejillas de sección en una gota de solución de glicina 0,05 M durante 10 min a temperatura ambiente. Seca los bordes de la rejilla en papel de filtro para eliminar la solución de glicina residual.
- Prepare una solución de glicina de 0,05 M (ver Tabla de Materiales) disolviendo 3,75 mg de glicina en 1 mL de PBS 1x (pH 7,4).
- Coloque las rejillas de sección en 10-20 μL de solución de bloqueo durante 25 min a temperatura ambiente.
nota: Composición de la solución bloqueante: 2 μL de suero de cabra normal (NGS) al 1% + 20 μL de BSA al 1% (concentración final: 10%) + 178 μL de 1x PBS (pH 7,4) para hacer un volumen final de 200 μL.
- Seque los bordes de la rejilla en papel de filtro y coloque la sección de la rejilla sobre el diluyente de anticuerpos para acondicionar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Incubar las secciones de la rejilla con anticuerpo primario (Sigmar1 en este caso, ver Tabla de Materiales; diluido 1:10 en diluyente de anticuerpos) durante 1 h 30 min en una cámara humidificada.
- Seque la rejilla y lave las secciones de la rejilla con diluyente de anticuerpos dos veces durante 5 minutos cada una.
- Incubar las secciones de la rejilla con anticuerpo secundario biotinilado (en este caso, anticuerpo secundario policlonal anti-conejo de cabra biotinilado, ver Tabla de Materiales; diluido 1:10 en diluyente de anticuerpos) durante 1 h en una cámara humidificada.
- Seque la rejilla y lave las secciones de la rejilla con diluyente de anticuerpos dos veces durante 5 minutos cada una.
- Incubar las secciones de la rejilla en QD conjugado con estreptavidina disponible comercialmente (QD655 nm, ver Tabla de Materiales; diluido 1:10 en diluyente de anticuerpos) durante 1 h en una cámara humidificada a temperatura ambiente. Evite la exposición a la luz cubriendo la cámara con papel de aluminio.
- Seque los bordes de la rejilla con papel de filtro y lave las secciones de la rejilla colocándolas sobre gotas de agua durante 2 minutos.
- Seca los bordes de la rejilla para que se sequen.
Tabla 1: Composición de PBS y otras soluciones utilizadas para la deshidratación de tejidos.
| búfer | composición | cantidad |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) (1x) (1 L) | cloruro de sodio | 8 g |
| Cloruro de potasio | 0,2 g |
| Fosfato de sodio dibásico | 1,44 g |
| Fosfato de potasio monobásico | 0,24 g |
| Ajusta el pH a 7,4 | |
Tabla 2: Aplicación de alcohol graduado y acetona para la deshidratación de tejidos (Paso 2.5)
| componente | Hora |
| 50% de etanol | 10 minutos |
| 70% etanol | 10 minutos |
| 95% de etanol | 10 minutos |
| 100% etanol | 20 minutos |
| 100% etanol | 20 minutos |
| 100% acetona | 30 minutos |
| 100% acetona | 30 minutos |