$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación animal y fijación renal
- Realice la fijación de perfusión siguiendo los pasos que se indican a continuación.
- Anestesiar al ratón por inhalación de isoflurano (3%, 2,0 L/min) y administración intraperitoneal de clorhidrato de medetomidina (0,3 mg/kg), tartrato de butorfanol (5 mg/kg) y midazolam (4 mg/kg) (ver Tabla de Materiales).
- Perfundir el animal con 20 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y 30 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% en tampón fosfato (PB) a través del ventrículo izquierdo del corazón.
- Realizar la fijación por inmersión justo después de la fijación por perfusión y la toma de muestras renales.
- Sumerja el riñón en PFA al 4% a 4 °C durante 16 h adicionales, luego lávelo con PBS durante 2 h (tres veces)9 (Figura 1).
cautela: El formaldehído y el paraformaldehído son irritantes tóxicos. Manipule los reactivos en una campana extractora con el equipo de protección personal adecuado.
>2. Decoloración y delipidación
- Prepare CUBIC-L (Cócteles de imágenes cerebrales / corporales claras y sin obstrucciones y análisis computacional) para la decoloración y la delipidación que consisten en un 10% en peso de Triton X-100 y un 10% en peso de N-butildietanolamina (ver Tabla de materiales), siguiendo los informes publicados anteriormente.
- Realice la decoloración y deslipidación por CUBIC-L siguiendo los pasos que se indican a continuación.
- Sumerja el riñón fijo en 7 mL de CUBIC-L al 50% (v/v) (mezcla 1:1 de agua y CUBIC-L) en un tubo de fondo redondo de 14 mL (ver Tabla de Materiales) con agitación suave a temperatura ambiente durante 6 h (Figura 2A). A continuación, sumérjalo en 7 mL de CUBIC-L en un tubo de fondo redondo de 14 mL agitando suavemente a 37 °C durante 5 días.
- Actualice CUBIC-L todos los días durante este proceso. Después del proceso de decoloración y deslipidización, lavar el riñón con PBS a temperatura ambiente durante 2 h (tres veces) (Figura 1). Utilice una cuchara dispensadora para la manipulación de muestras (Figura 2B).
>3. Tinción inmunofluorescente de montaje completo
- Prepara los tampones de tinción.
- Prepare el tampón de tinción para anticuerpos primarios mezclando Triton X-100 al 0,5 % (v/v), caseína al 0,5 % en PBS y azida de sodio al 0,05 %.
- Prepare el tampón de tinción para anticuerpos secundarios mezclando Triton X-100 al 0,5 % (v/v), caseína al 0,1 % en PBS y azida de sodio al 0,05 %.
- Realizar la tinción con anticuerpos primarios.
- Inmunotinción del riñón deslipidioado con anticuerpos primarios (1:100 o 1:200, ver tabla de materiales) en el tampón de tinción a 37 °C con agitación suave durante 7 días.
nota: La cantidad de tampón de tinción necesaria para un riñón es de 500-600 μL (Figura 2C).
- Lave el riñón con Triton X-100 al 0,5 % (v/v) en PBS (PBST) a temperatura ambiente durante 1 día (Figura 1).
- Realizar la tinción con anticuerpos secundarios.
- Inmunotinción del riñón con anticuerpos secundarios (1:100 o 1:200, ver tabla de materiales) en el tampón de tinción a 37 °C con una agitación suave durante 7 días. Lavar el riñón con PBST a temperatura ambiente durante 1 día (Figura 1).
- Después de la fijación, sumergir el riñón en formaldehído al 1% en PB (mezcla 1:36 de formaldehído al 37% y PB) durante 3 h, y lavarlo con PBS a temperatura ambiente durante 6 h (Figura 1).
>4. Coincidencia del índice de refracción (RI)
- Prepare CUBIC-R+.
- Prepare CUBIC-R mezclando 45% en peso de 2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolona/antipirina y 30% en peso de nicotinamida (ver Tabla de Materiales).
- Prepare CUBIC-R+ para la coincidencia del índice de refracción (IR) mediante la adición de 0,5 v% de N-butildietanolamina a CUBIC-R siguiendo los informes publicados anteriormente.
- Realice la coincidencia de instancias reservadas.
- Sumerja el riñón en 7 mL de CUBIC-R+ al 50% (v/v) (mezcla 1:1 de agua y CUBIC-R+) en un tubo de fondo redondo de 14 mL con agitación suave a temperatura ambiente durante 1 día. A continuación, sumérjalo en 7 mL de CUBIC-R+ en un tubo de fondo redondo de 14 mL agitando suavemente a temperatura ambiente durante 2 días (Figura 1).
nota: Aunque el riñón flota en un 50% de CUBIC-R+ al comienzo de la compatibilidad de IR, se hunde y se vuelve transparente en CUBIC-R+ al final del proceso (Figura 2D).
>5. Adquisición y reconstrucción de imágenes
- Sumerja el riñón compatible con RI en una mezcla de aceite de silicona (IR = 1,555) y aceite mineral (RI = 1,467) (55:45) durante la adquisición de imágenes (IR = 1,51) (Figura 3).
- Adquiera imágenes en 3D de todo el riñón con un microscopio fluorescente de hoja de luz hecho a medida (consulte la Tabla de materiales). Recopile todos los datos de imagen sin procesar en un formato TIFF de 16 bits. Visualice y capture las imágenes renderizadas en 3D con el software de análisis de imágenes (Imaris, consulte la tabla de materiales).
