Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto,
1. Colección de biopsias de piel
- Permita que un médico calificado realice la biopsia de piel en un entorno clínico adecuado.
- Elija el área para realizar la biopsia de piel y límpiela con un hisopo con alcohol.
- Preparar la solución anestésica con 1 cc de lidocaína al 2%.
- Con la aguja paralela a la zona, inyecte anestesia local por vía subcutánea.
- Después de comprobar el efecto de la anestesia, tome el punzón desechable de 3 mm y aplique una presión rotacional y delicada hacia abajo para rotarlo hacia abajo a través de la epidermis y la dermis, hasta llegar a la grasa subcutánea.
- Retira el puñetazo.
- Use pinzas desechables para tirar suavemente del tapón cutáneo hacia arriba.
- Use tijeras para cortar la base de la muestra a nivel del tejido graso.
- Coloque la muestra en un tubo que contenga 10 mL de solución fijadora de periodato-lisina-paraformaldehído (PLP).
- Desinfecta la zona y cúbrela con una venda adhesiva.
>2. Fijación y almacenamiento de tejidos
- Prepare una nueva solución fijadora de PLP (ver Tabla 1).
- Inmediatamente después de la recogida de la biopsia de piel, sumergirla en un tubo que contenga 10 mL de solución fijadora de PLP e incubarla durante la noche (O/N) a 4 °C.
- Al día siguiente, bajo la campana extractora, retirar suavemente el fijador PLP y en el mismo tubo, lavar la biopsia 3 veces durante 5 min con 5 mL de solución de Sorensen 0,1 M (Tabla 1).
- Deseche la solución de Sorensen e incube la biopsia con 5 mL de solución crioprotectora O/N a 4 °C.
- Almacene la biopsia a 4 °C si el corte con criotomo se realiza dentro de 1 semana; almacene la biopsia a -20 °C si el corte se realiza dentro de los 3 meses; incruste la biopsia en un criomold (pasos 3.2-3.4) y guárdela a -80 °C para conservarla durante un período de tiempo más largo.
>3. Tejido cortado con un criotomo
- Ajuste el criotomo a -20 °C.
- Tome un molde criomónico y llénelo con el medio crioincrustante. Evita crear burbujas.
- Con unas pinzas, sumerja la biopsia en el medio crioincrustado con el eje longitudinal (epidermis - dermis) paralelo a la parte inferior del criomolde.
- Congele la muestra con nitrógeno líquido para obtener un cubo sólido de medio crio-incrustado que contenga la biopsia en la orientación correcta.
- Coloque la muestra en el criostato y espere 30 minutos para permitir que la biopsia se aclimate.
- Fije la muestra en el criostato y corte secciones de 50 μm.
- Con la ayuda de un pequeño cepillo, transfiera las secciones criogénicas en una placa de 96 pocillos que contenga 200 μL de solución anticongelante en cada pocillo. Una sección por pozo.
- Almacenar a -20 °C.
nota: Si no se analiza toda la biopsia, córtela solo parcialmente. En este caso, las secciones deben almacenarse a -20 °C y la parte restante de la biopsia a -80 °C para conservarla durante más tiempo.
>4. Tinción de inmunofluorescencia
- Llene una placa de 96 pocillos, con 100 μL de solución de lavado.
- Transfiera las secciones a analizar de la placa de almacenamiento a la nueva que contiene la solución de lavado. 1 sección por cada pocillo (4 secciones por sitio anatómico, por paciente: generalmente un total de 12 secciones por paciente).
- Deje la sección en la solución de lavado durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT). Transfiera la sección a otro pocillo que contenga la misma solución y repita el lavado.
- Mover las secciones a nuevos pocillos que contengan 100 μL de solución de bloqueo e incubar durante al menos 90 min y durante un máximo de 4 h a RT.
- Diluir los anticuerpos primarios anti-PGP9.5 (policlonal de conejo, 1:1000) y anti-5G4 (monoclonal de ratón, 1:400) en la solución de trabajo.
- Transfiera las secciones a nuevos pocillos que contengan 100 μL de la solución de trabajo de los anticuerpos primarios e incube O/N en RT.
- Como paso 4.3, lavar las secciones 2 veces durante al menos 10 min a RT, con 100 μL de solución de lavado.
- Diluir los anticuerpos secundarios (conjugados con diferentes fluoróforos) Goat anti-Rabbit para detectar PGP9.5 (1:700) y un Goat anti-Mouse para detectar 5G4 (1:700) en la solución de trabajo.
- Transfiera las secciones a nuevos pocillos que contengan 100 μL de la solución de trabajo de los anticuerpos secundarios durante 90 min en RT. A partir de este punto, cubra la placa de 96 pocillos con papel de aluminio para evitar el blanqueo del fluoróforo conjugado con anticuerpo secundario.
- Como paso 4.3, lavar las secciones 2 veces durante al menos 10 min, con 100 μL de la solución de lavado.
- Transfiera las secciones a nuevos pocillos que contengan 100 μL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, diluido 1:5.000 en solución salina tamponada con fosfato [PBS] 1x) durante 5 min a RT.
- Como paso 4.3, lavar las secciones 2 veces durante al menos 10 min, con 100 μL de la solución de lavado.
- Monta las secciones en una corredera en la posición correcta evitando que se plieguen mal.
- Agregue unas gotas del medio de montaje en la corredera y cúbrala con un cubreobjetos.
- Deje que los portaobjetos se sequen O/N antes de usar el microscopio confocal/fluorescencia.
- Guarde las diapositivas en una caja adecuada a 4 °C evitando la exposición a la luz. Si se almacena con precisión, la señal será visible durante unos 6 meses.
nota: La transferencia de una sección de la placa de 96 pocillos que contiene las rodajas recién cortadas a la placa de 96 pocillos que contiene la solución de lavado (paso 4.1) se realiza utilizando un cepillo pequeño que ayuda a recoger la biopsia. Después de la transferencia de la sección al primer pocillo, cada vez que sea necesario incubar la rebanada con una solución diferente, muévala de un pocillo a otro con la ayuda del cepillo.
>5. Imágenes de inmunofluorescencia
- Vea las secciones bajo un microscopio de fluorescencia invertida o un microscopio confocal (aumento de 20X, 40x o más, use fotogramas sucesivos de incrementos de 2 μm en un plan de pila Z para obtener mejores resultados).
- Adquisición de imágenes mediante una cámara conectada al microscopio
- Utilice un software de imagen adecuado (es decir, ImageJ) para analizar las señales positivas en secciones en términos de distribución espacial e intensidad de la señal. Para ello, realice los pasos que se mencionan a continuación.
- Abra el archivo con el software ImageJ.
- Haga clic en Imagen > color > canales divididos para analizar cada canal de color.
- Haga clic en Imagen > pila > proyecto Z para obtener una combinación de varias adquisiciones de sección.
- Haga clic en Imagen > canales de combinación de > de color para obtener una combinación de diferentes canales de color de la misma adquisición.
Tabla 1: Soluciones requeridas. Lista de soluciones requeridas para el protocolo y breve descripción de cómo prepararlo.
Solución anticongelante
(almacenar a 4 °C durante un máximo de 6 meses) | 30% Glicerol
30% Etilenglicol
30% dH2O
10% 2x Tampón de fosfato |
Solución de bloqueo
(prepárese en este momento) | 4% Suero de Cabra Normal
1% Triton X-100
en Solución de lavado |
Crioprotector
(almacenar a 4 °C durante un máximo de 6 meses) | 20% Glicerol
80% La solución de Sorensen |
Solución de fosfato de hidrógeno disódico
(almacenar en RT hasta 6 meses) | 0,45M Fosfato de hidrógeno disódico (Na2HPO4) en dH2O
Filtrar en un frasco estéril |
Solución de lisina
(almacenar a 4 °C durante un máximo de 3 semanas) | 50% de solución de monoclorhidrato de L-lisina 0,3M
50% de la solución 0.1M de Sorensen pH 7.6
pH 7.4, filtro en un frasco estéril |
Paraformaldehído (PFA) 8%
(preparar bajo la campana extractora y almacenar a 4 °C hasta por 1 mes) | 2,6 M de PFA en dH2O (hasta 55 °C_do no exceder los 60 °C para evitar la formación de ácido fórmico)
Filtrar en un frasco estéril |
Tampón de fosfato 2x
(almacenar a 4 °C durante un máximo de 6 meses) | Solución de fosfato monosódico (NaH2PO4) al 6%
Solución de fosfato disódico al 45% (Na2, HPO4) en dH2O |
solución fijadora PLP
(preparar en el momento, bajo la campana extractora) | 25% Paraformaldehído 8%
0.01M (meta)periodato de sodio
Solución de lisina al 75% |
Dihidrógeno fosfato de sodio monohidratado
(almacenar en RT hasta 6 meses) | 0.52M Dihidrógeno fosfato de sodio monohidratado (NaH2PO4 * H2O) en dH2O
Filtre en un frasco estéril. |
La solución de Sorensen
(almacenar a 4 °C hasta por 1 mes) | Solución de fosfato monosódico al 2,5%
Solución de fosfato disódico al 18,7%
pH 7,6, en dH2O |
Solución de lavado
(prepárese en este momento) | 0.25M Trizma base
0,26 millones de NaCl
pH 7,6, en dH2O |
Solución de trabajo
(prepárese en este momento) | 50% Solución de bloqueo
Solución de lavado al 50% |
