Uso de la tomografía mediada por fluorescencia para evaluar la inflamación intestinal murina

Resumen

Fuente: Nowacki, T. M., et al. Tomografía mediada por fluorescencia para la detección y cuantificación de la inflamación intestinal murina relacionada con macrófagos. J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra una técnica para evaluar la infiltración de macrófagos intestinales en un modelo murino de colitis utilizando tomografía mediada por fluorescencia (FMT). Al inducir colitis en un ratón a través del sulfato de sodio de dextrano (DSS), se inyectan al animal anticuerpos que reconocen el marcador de glicoproteína F4/80 en los macrófagos infiltrados en el colon. A continuación, se obtiene una imagen del ratón en un dispositivo FMT en el que las señales de fluorescencia y reflectancia se reconstruyen en una imagen tridimensional para determinar la distribución espacial y la intensidad de la fluorescencia.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Materiales y configuración experimental

1. Cuidado de los animales.
   1. Utilice ratones del mismo sexo y edad de cualquier cepa susceptible al DSS (por ejemplo, C57BL/6) con un peso corporal de 20-25 g.
   2. Planifique al menos cinco o más ratones por grupo experimental y aloje a los ratones de acuerdo con las pautas locales de cuidado de animales.
   3. Proporcionar una dieta estándar de comida para roedores y agua potable esterilizada en autoclave ad libitum.
   4. Retire el chow estándar y reemplácelo con chow sin alfalfa al menos tres días antes de la exploración para reducir la autofluorescencia endoluminal.
2. Inducción de colitis aguda inducida por DSS.
   1. Disuelva 2 g de DSS (peso molecular ~40.000 Da) en 100 mL de agua potable esterilizada en autoclave para obtener una solución al 2% (p/v).
   2. Llene el suministro de bebida de los ratones exclusivamente con la solución DSS y calcule 5 mL de líquido por ratón por día. Proporcione la misma agua potable sin DSS a los ratones de control.
      nota: Monitorea a los ratones diariamente hasta el final del experimento. Sacrificar a los ratones que pierden más del 20% de su peso corporal inicial o que se vuelven moribundos (es decir, postura encorvada persistente, disminución del movimiento, respiración dificultosa, pelaje marcadamente erguido) de acuerdo con las pautas locales aplicables sobre bienestar animal.
3. Preparación de tomografía mediada por fluorescencia.
   1. Marque el anticuerpo deseado (p. ej., rata anti-ratón F4/80) con colorante de fluorescencia (p. ej., cianina 7,_{λ excitación}: 750 nm,_{λ emisión}: 776 nm) como se describe en el protocolo del fabricante. Diálisis del anticuerpo purificado en una membrana de diálisis adecuada (tamaño de poro < 50-100 kDa) contra 1 L de cloruro sódico 0,15 M durante al menos 2 h o toda la noche.
      1. Transfiera el anticuerpo a 1 L de NaHCO₃ 0,1 M y dialice durante al menos 2 h.
      2. Disuelva la cantidad necesaria de colorante fluorescente en dimetilsulfóxido (DMSO) (10,8 μL/mg de anticuerpo) y añádalo a la solución de anticuerpos. Utilice el tinte fluorescente en un exceso molar de 20 veces para lograr una proporción de colorante a proteína de 1:3.
      3. Incubar en la oscuridad a 4 °C durante 1 h. Eliminar los anticuerpos no marcados por diálisis contra 1 L de sodio 0,15 M o mediante el uso de una columna de desalinización de PD-10 y disolver en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para aplicación in vivo.
      4. Determine la concentración final de anticuerpos y la proporción de marcaje mediante espectrofotometría.
      5. Mida la concentración de proteínas a una absorción de 250-330 nm y considere la absorción adicional por el colorante. Corrija la absorción máxima a 280 nm (proteína) en un 11% de la absorción máxima a 750 nm (siguiente paso) para el marcado con cianina.
      6. Mida una dilución del compuesto (normalmente 1:10) a 250-800 nm y extraiga la concentración de cianina7 a 750 nm.
      7. Determine la relación colorante-proteína como: colorante/anticuerpo = absorción máxima a 750 nm / 200.000 / (absorción máxima a 280 nm - 0,11 x absorción máxima a 750 nm) / 170.000.
      8. Mantenga la solución de anticuerpos a 4 °C y protéjala de la luz para evitar el blanqueo antes de la inyección.
   2. Cargue el volumen necesario de solución de anticuerpos en una jeringa estéril inmediatamente antes de la inyección y protéjala de la luz hasta que se utilice.
   3. Determine el momento óptimo de la inyección de la sonda y el procedimiento de exploración, en función de la farmacocinética del trazador.
   4. Anestesiar a los ratones con isoflurano inhalado al 1,5 - 2,5% en oxígeno o colocarlos de forma segura en un sistema de retención específico para la inyección en la vena de la cola de los anticuerpos marcados.
   5. En el caso de los anticuerpos de longitud completa, inyecte el anticuerpo marcado al menos 24 horas antes de la exploración, como en el caso de la visualización de macrófagos F4/80 anti-ratón en la colitis murina. Inyectar ratones por vía intravenosa (i.v.) a través de la vena de cola con anticuerpos marcados en una cantidad correspondiente a 2,0 nmol de colorante.
   6. Utilizar anticuerpos inespecíficos igualmente marcados (por ejemplo, IgG de rata u otro isotipo correspondiente a la herencia de anticuerpos primarios) como control de isotipo en dosis equivalentes a las de la sonda específica
      nota: Los resultados de los escaneos in vivo después de la inyección del compuesto de control pueden servir como referencia para la interpretación de los datos específicos de las imágenes de la sonda.
   7. Use una maquinilla de afeitar eléctrica para afeitar el pelaje del animal en la región abdominal para minimizar el reflejo y la absorción de la luz.

2. Equipamiento técnico

1. Utilice un dispositivo veterinario de tomografía mediada por fluorescencia (TMF) para la fluorescencia en animales pequeños (Figura 1).
2. Cree un nuevo estudio para cada proyecto haciendo clic en el botón "nuevo estudio" e incluya en la descripción del estudio los trazadores relevantes, incluidos los parámetros de imagen y las dosis para referencia futura.
3. Dentro de este estudio, cree grupos de estudio de acuerdo con el diseño de estudio respectivo (por ejemplo, para el trazador específico y el control de isotipo inespecífico) haciendo clic en el botón "nuevo grupo de estudio". Equipar a cada grupo de estudio con el número respectivo de animales.
4. Calibrar el sistema para las construcciones de trazadores.
   1. Realice la calibración de cada lote de trazadores para normalizar la variación en el etiquetado y permitir la medición cuantitativa a partir de los datos de OI.
   2. Siga las instrucciones del fabricante del instrumento para la calibración de cada sistema individual; al seleccionar "agregar nuevo trazador", el sistema proporcionará una guía a través de los pasos. Proporcione la dilución de la solución de anticuerpos aplicada y la concentración absoluta calculada del trazador en la sonda.
   3. En el caso del TMF, utilice un maniquí que imite el tejido de un grosor y unas características de absorción definidos (que se asemejen al tejido vital) y llénelo con un volumen específico de la solución de anticuerpos utilizada. Medir esto en el dispositivo FMT.
      nota: El sistema utilizará la medición de referencia de la sonda suministrada, junto con la concentración dada, para calcular las concentraciones absolutas de trazadores a partir de futuras mediciones in vivo.
5. Utilice un casete de examen calefactable con una temperatura de 42 °C.
   nota: Esto evita que los ratones sufran hipotermia durante el examen.

>3. Anestesia animal

1. Utilice un flujo continuo de isoflurano al 1,5 - 2% en % en volumen ([2-cloro-2-(difluorometoxi)-1,1,1-trifluoro-etano]) y 1,5 L O₂/min para anestesiar a los ratones. Utilice sistemas de inhalación especialmente diseñados para la anestesia en roedores (vaporizador de isoflurano) para controlar fácilmente la profundidad del anestésico y minimizar la exposición del personal.
2. Coloque el ratón en la cámara de inducción a prueba de fugas y encienda el vaporizador para el suministro de isoflurano (100% (v/v), 5 vol% en oxígeno, 3 L/min). Vigile el ratón hasta que quede recostado e inconsciente.
3. Colóquelo en el casete de examen para tomografía, con inhalación continua de isoflurano a través del cono nasal a una dosis de 100% v/v, 1,5 vol% en oxígeno, 1,5 L/min para minimizar los artefactos de movimiento durante el examen. Para procedimientos que duran más de 5 minutos, aplique ungüento ocular a los ojos del ratón para prevenir el daño a la córnea.
4. Evalúe la profundidad anestésica comprobando los reflejos. Coloca el ratón boca arriba; Si la anestesia es suficiente, el ratón no debe darse la vuelta. Pellizca el ratón suavemente entre los dedos de los pies; Si la anestesia es suficiente, no se retirará la pierna (etapa de tolerancia quirúrgica).

>4. Tomografía mediada por fluorescencia

NOTA: Adapte los siguientes detalles, que son específicos del sistema FMT utilizado en este estudio (consulte la Tabla de Materiales) para dispositivos alternativos de imágenes de reflectancia de fluorescencia o sistemas FMT, según sea necesario.

1. Coloque el ratón anestesiado boca arriba en el casete de examen.
2. Realice el procedimiento de escaneo.
   1. Inserte el casete en el sistema de imágenes y ciérrelo inmediatamente para garantizar una anestesia continua. Seleccione la muestra apropiada de la comisión de estudio creada anteriormente. Seleccione el trazador administrado en el menú desplegable para asegurarse de que los valores de la concentración del trazador se calculen correctamente.
   2. Adquiera una imagen de reflectancia de fluorescencia a la longitud de onda adecuada (720 nm para Cyanine7) para la planificación de la exploración y delinee el campo de exploración haciendo clic en el botón "adquirir imagen".
   3. Observe que el campo de escaneo aparece como una superposición en la imagen de reflectancia de fluorescencia. Ajústelo a la región de interés (por ejemplo, colon o abdomen), evitando el aire o las áreas de pelo restante. Dependiendo del objetivo de la imagen, establezca el número de puntos de datos de la imagen dentro del campo de escaneo eligiendo entre la resolución del campo de escaneo grueso a medio y fino en el menú de la derecha.
      nota: Tenga en cuenta que un campo de escaneo fino puede ofrecer una mejor resolución espacial a costa de un tiempo de escaneo significativamente más largo.
   4. Inicie la adquisición de datos/imágenes en la longitud de onda seleccionada haciendo clic en "escanear".
      nota: El tiempo de exploración para una exploración mediana-fina de todo el abdomen será de alrededor de 5 minutos; En este tiempo, cada punto de datos es iluminado por separado por el láser de excitación y se registra la fluorescencia resultante.
   5. Retire al animal del casete de imágenes al final de la exploración y permita que el animal se recupere por completo antes de volver a colocarlo en la jaula.
   6. Repita el TMF si se considera necesario en varios momentos durante el experimento (por ejemplo, días 0, 5 y 9 - 10 (final del experimento)), pero considere la acumulación de anticuerpos en el cuerpo, aumentando así la señal de fluorescencia de fondo.

>5. Reconstrucción e interpretación de datos

1. Utilice la herramienta de reconstrucción del software de imagen respectivo para crear mapas 3D de la distribución de fluorescencia a partir de los datos de imagen en bruto; los escaneos se agregan automáticamente a la herramienta de reconstrucción cuando al escanear se selecciona la función "agregar a la cola de reconstrucción".
   1. De lo contrario, seleccione las exploraciones en el menú desplegable debajo del estudio y el grupo de estudio respectivos, haga clic con el botón derecho en la exploración y seleccione "agregar a la reconstrucción".
2. Para un análisis más detallado, cargue un conjunto de datos en el software de análisis. En el menú desplegable de la barra superior, seleccione el estudio respectivo y, a continuación, seleccione el grupo de estudio y el animal individual en el menú de la derecha; Se mostrarán todas las exploraciones realizadas para este animal. Seleccione el escaneo correcto y haga clic en "cargar".
   nota: La reconstrucción 3D de la distribución del trazador aparecerá a la izquierda como una superposición de la imagen de reflectancia de fluorescencia adquirida inicialmente. El modelo se puede rotar y ampliar para facilitar el análisis.
3. Identificar los focos de acumulación de etiquetas inespecíficas (p. ej., hígado u orina, vejiga) en mapas 3D reconstruidos y diferenciarlos de los tejidos diana (p. ej., intestino o intestino).
4. En la barra superior, seleccione la forma de ROI más adecuada para el objetivo. Etiquete el tejido objetivo como regiones de interés (ROI) colocando las herramientas de medición respectivas en el software de análisis; el software proporcionará una intensidad de fluorescencia para el ROI, así como cantidades (pico-)molares del trazador para el que se ha calibrado el escaneo.
5. Seleccione la cantidad total de trazador en el ROI apropiado, normalizado para el tamaño del ROI, como el equivalente más adecuado para la evaluación de la actividad de la enfermedad en correlación con el infiltrado inflamatorio (histología).
   nota: Se pueden elegir otras características del ROI, si corresponde, como representativas del modelo en particular.

Resultados

Figura 1. Visualización tomográfica de infiltrados de macrófagos en colitis murina.

Exploraciones de FMT en ratones colíticos y controles no colíticos a los que se les administró un anticuerpo conjugado con cianina 7 contra F4/80 murino (n = 5 por grupo). (A) Gráfico de barras: la intensidad de fluorescencia total en pmol de colorante se determ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos
Dieta sin alfalfa	Harlan Laboritories, Madison, Estados Unidos	Año 2014
Ungüento oftalmológico Bepanthen	Bayer, Leverkusen, Alemania	80469764
Sulfato de dextrano sódico (DSS)	Consulatación TdB, Uppsala, Suecia	DB001
eosina	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemania	E 4382
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemania	E 9884
Florene 100V/V	Abbott, Wiesbaden, Alemania	B506
Hematoxilina	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemania	HHS32-1L
Compuesto O.C.T. Tissue Tek	Sakura, Zoeterwonde, Países Bajos	4583	Fijador para análisis histológicos
Solución salina tamponada con fosfato, PBS	Lonza, Verviers, Bélgica	4629
Cloruro de sodio 0,9%	Braun, Melsungen, Alemania	5/12211095/0411
Bicarbonato de sodio en polvo	Sigma Aldrich Deisenhofen, Alemania	S5761
Dieta estándar	Altromin, Lage, Alemania	Año 1320
Moldeo criomático Tissue-Tek	Sakura, Leiden, Países Bajos	4566
Hemoculto (prueba de papel de guayaco)	Beckmann Coulter, Alemania	3060
Biotina rata anti-ratón anti-F4/80	Serotec, Oxford, Reino Unido	MCA497B
Biotina rata-anti-ratón anti-GR-1	BD Pharmingen, Heidelberg, Alemania	553125
Estreptavidina-Alexa546	Sondas moleculares, Darmstadt, Alemania	S-11225	Excitación/emisión máxima: 556/573nm
Anticuerpo anti-CD11b rata-anti-ratón TC	Calteg, Burlingame, Estados Unidos	R2b06
Anticuerpo anti-ratón F4/80 purificado	BioLegend, Londres, Reino Unido	123102
DAPI	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania	D9542
Anticuerpo anti-rata-rata-anti-ratón conjugado con FITC	BD Pharmingen, Heidelberg, Alemania	553104
Búfer FACS	BD Pharmingen, Heidelberg, Alemania	342003
Cy7 NHS Éster	GE Healthcare Europe, Friburgo, Alemania	PA17104
MPO ELISA	Immundiagnostik AG, Bensheim, Alemania	K 6631B
Anticuerpo F4/80 anti-ratón marcado con Cy5.5	BioLegend, Londres, Reino Unido	123127	Anticuerpos marcados listos para usar (alternativa)
Antígeno anti-ratón F4/80 perCP-cianinina5.5	eBioscience, Waltham, EE. UU.	45-4801-80	Anticuerpos marcados listos para usar (alternativa)
DMSO (dimetilsulfóxido)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania	67-68-5
Isoflurano	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania	792632
etanol	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania	64-17-5
Albúminas séricas bovinas (BSA)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania	A4612
Solución salina tamponada Tris (TBS)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania	SRE0032
equipo
Sistema de citometría de flujo FACS Calibur	BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Alemania
Sistema de imagen in vivo FMT 2000	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, EE. UU.	FMT2000
Software de análisis de imágenes True Quant 3.1	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, EE. UU.	incluido en FMT2000
Microscopio fluorescente Leica DMLB	Leica, 35578 Wetzlar, Alemania	DMLB
Bandelín Sonopuls HD 2070	Bandelin, 12207 Berlín, Alemania	HD 2070	homogeneizador ultrasónico
Bisturí desechable n.º 10	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania	Z692395-10EA
Tijeras Metzenbaum 14cm	Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Alemania	22398330
Jeringa Luer Lock 5ml	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania	Z248010
agujas de jeringa	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania	Z192368
Tubo Halcón 50ml	BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica	352070