Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Diseño de diseño y producción de matrices personalizadas
- Genere una hoja de cálculo de secuencias de péptidos con las correspondientes denominaciones alélicas. La matriz tiene 20 filas y 30 columnas y puede contener hasta 20x30 = 600 puntos para péptidos. Dependiendo del número total de péptidos registrados en el paso 1.5 de un donante en particular, y basándonos en nuestra experiencia pasada con dos ejemplos que habíamos probado, la matriz de 600 puntos puede contener todas las secuencias generadas a partir de ~ 2 casos de trasplante separados.
- Planifique racionalmente la forma más eficiente de ajustar los conjuntos de péptidos dentro del formato de 600 puntos de la matriz.
- Si más de un sujeto puede caber en una matriz completa, inserte filas vacías después de las secuencias del primer donante para que coincidan con el número total de filas que se pueden dividir por 30 (el número de puntos en una fila en la matriz).
- Inmediatamente después de la última fila vacía para el primer conjunto de secuencias, pegue toda la columna del contenido de la secuencia del segundo caso de trasplante.
- Repita estos pasos hasta que la matriz esté llena y no se puedan agregar más casos sin exceder los 600 puntos. Si se dejan filas vacías enteras para llenar en la parte inferior, "mueva" la fila vacía para que se coloque entre los dos conjuntos de donantes. Este amplio espacio que queda entre los casos facilita el corte de la membrana después de completar la síntesis, siguiendo el paso 2.2. abajo.
- Programe las secuencias de péptidos en el contexto del diseño de la matriz. El programa del sintetizador SPOT toma un formato de texto de las secuencias (una fila, una secuencia de péptidos), que se puede obtener directamente guardando la hoja de cálculo resultante del paso 1.1.4 como un documento de texto simple (sin las columnas adicionales para los nombres de los alelos, las posiciones aa, etc.).
- Ejecute la síntesis automatizada de matrices de péptidos a través del sintetizador SPOT. Toda la operación de la síntesis se detalla en Kudithipudi et al. Tenga en cuenta que la síntesis de Fmoc de dos matrices tarda ~ 4-5 días.
>2. Probar y reprobar antisueros a partir de una serie temporal de un receptor de trasplante individual.
NOTA: El arreglo de membranas de 600 puntos tiene las dimensiones ~7 cm x 13 cm. Después de la síntesis, las matrices pueden almacenarse a temperatura ambiente como membranas secas durante al menos dos años cuando están protegidas de la luz directa. Evite el plegamiento excesivo de la membrana para preservar su longevidad para un uso repetido.
- Rehidrate la matriz de membranas con etanol y visualice las manchas peptídicas teñidas con Ponceau S.
- Rehidratar la matriz de membranas que transporta los péptidos siguiendo un procedimiento escalonado optimizado en Li et al.
- Sumerja la membrana del array en 20 mL de etanol al 100%.
- Agregue 20 ml de agua destilada para diluir la solución a etanol al 50% e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Cambie la solución de inmersión a 40 ml de agua al 100% tres veces e incube 15 min cada vez.
- Lave con un tampón de trabajo adecuado, por ejemplo, 20 ml de TBST (solución salina tamponada con Tris con 0,1%), tres veces durante 5 minutos cada una.
- Tinción de Ponceau S de la matriz para visualizar péptidos sintéticos
- Agregue 20 mL de solución preformulada de Ponceau S directamente a la matriz hidratada e incube durante ~ 30 s con agitación.
- Deje correr agua destilada continuamente sobre la membrana para eliminar las manchas del color de fondo Ponceau S. Durante el proceso, pueden hacerse visibles manchas peptídicas de color rojo.
- Separe las porciones de la matriz para cada donante cortando cuidadosamente entre las secciones de la matriz para casos individuales. Marque la orientación de cada matriz.
- Matriz de bloques previos.
- Bloquee la membrana en 20 mL de leche descremada al 5% disuelta en tampón TBST. Esta solución a base de leche eliminará aún más las manchas del color Ponceau S. Reemplace el tampón de leche varias veces para lograr las imágenes de péptidos más claras.
- Para fines de mantenimiento de registros, tome una foto de la imagen Ponceau S del conjunto utilizando una cámara de mano (ejemplo en la Figura 1).
- Continuar bloqueando la membrana en la leche descremada al 5% a 4 °C durante la noche o a temperatura ambiente durante 2 h con balanceo.
- Matriz de incubación con antisuero para trasplantes.
nota: Cabe señalar que un fenómeno conocido como prozona o efecto Hook puede ser el resultado de la interferencia dependiente del complemento en el análisis de anticuerpos séricos. Para evitar este problema, se puede considerar un paso opcional de pretratamiento sérico con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o inactivación por calor de las muestras de suero.
- Retire el tampón de bloqueo y lave la membrana con 20 ml de TBST tres veces al día siguiente durante 5 minutos cada vez.
- Añadir 20 μL del suero bruto del receptor a 20 mL de leche al 2,5% en tampón TBST e incubar con la membrana durante 2-3 h a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que en esta ronda inicial de sondaje, se recomienda utilizar primero el último suero postrasplante (o probablemente el suero más sensibilizado) de la serie temporal. Esto se basa en la suposición de que los especímenes más tempranos de la serie, particularmente de los puntos de tiempo previos al trasplante, tienen menos variedad de aloanticuerpos que tienden a desarrollarse con el tiempo. De este modo, se puede distinguir claramente cualquier posibilidad de interferencia de la señal por "arrastre" entre las rondas de sondaje de la reactividad de aloanticuerpos realmente desarrollada debido a las respuestas inmunitarias contra el injerto.
- Lave la matriz con 20 ml de TBST e incube con un anticuerpo secundario.
- Lave la membrana tres veces durante 10 minutos cada vez.
- Incubar con el anticuerpo secundario IgG-HRP (peroxidasa de rábano picante) antihumano de cabra a una dilución de 1:10.000 en tampón TBST suplementado con leche al 1% durante otras 2 h.
- Lava y revela la mancha.
- Lave la membrana tres veces con TBST durante 10 minutos cada vez.
- Realice la quimioluminiscencia mejorada (ECL) utilizando 5 mL de solución de luminol recién mezclada con 5 mL de solución de peróxido para desarrollar la membrana (durante 1 min).
- Visualice las señales ECL mediante un generador de imágenes adecuado (es decir, ChemiDoc Imaging Systems o Azure C600).
- Escanee y cuantifique la mancha.
- Guarde las imágenes reveladas (Figura 2, imagen inferior) y realice la cuantificación de la intensidad puntual.
>3. Compare la reactividad del antisuero en una serie de tiempo clínica.
- Quite la matriz.
- En este punto, mantenga la membrana húmeda en todo momento.
- Pele la membrana incubándola con 20 mL de tampón de extracción comercial a 37 °C durante 20 min, y luego lave la membrana con TBST tres veces durante 10 min cada una. A continuación, repita los pasos de bloqueo (paso 3.2) y sondaje (paso 3.3) utilizando un suero diferente del paciente tomado en un momento diferente.
- Membrana pelada en bloque.
Nota: Después de la extirpación, la membrana se puede reutilizar para otra ronda de sondaje de un suero diferente del mismo paciente en una serie temporal.
- Bloquee la membrana con tampón de leche al 5% como antes (ver paso 2.2).
- Vuelva a probar un antisuero diferente de la misma serie temporal (repita los pasos de 2.3 a 2.6; ejemplo en la Figura 2, imagen superior).
nota: La matriz despojada se puede utilizar para reprobar otra muestra de suero. Dado que los péptidos se conjugan covalentemente con la matriz de soporte de la membrana, demostramos que la matriz se puede reutilizar hasta 20 rondas de ciclos de extracción y reprobado sin perder su rendimiento.
