Detección de anticuerpos antiglicanos circulantes con una matriz de glicanos impresa

Resumen

Fuente: Olivera-Ardid, S. et al., Matriz de glicanos impresa: una técnica sensible para el análisis del repertorio de anticuerpos anticarbohidratos circulantes en animales pequeños.J. Vis. Exp.(2019)

Este video muestra la tecnología de matriz de glicanos impresa para analizar los anticuerpos antiglicanos circulantes en suero de ratón. Los anticuerpos en el suero interactúan con glicanos específicos en el chip, lo que se confirma mediante inmunotinción seguida de escaneo de fluorescencia.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Producción de glicochips

1. Preparación de microarrays
   1. Imprima los glicanos (50 mM) y los polisacáridos (10 μg/mL) en solución salina tamponada con fosfato de 300 mM (PBS, pH 8,5) a 6 réplicas en portaobjetos de vidrio derivatizados con N-hidroxisuccinimida, utilizando un matrizador robótico sin contacto (volumen de caída ~900 pL). Cada diapositiva contiene 4 bloques diferentes de sub-matrices (Figura 1A, en colores) repetidos 6 veces. Cada sub-array está formado por 112 puntos de glicanos diferentes, incluyendo controles (8 filas × 14 columnas) (Figura 1B).
      nota: La información relacionada con los glicanos se proporciona en la Tabla 1. La biblioteca de glicanos utilizada para imprimir microchips es el resultado de un esfuerzo sintético a largo plazo del equipo del IBCh; En publicaciones relacionadas se describen ejemplos de síntesis. La biblioteca de glicanos incluía antígenos del grupo sanguíneo y algunos de los oligosacáridos terminales más frecuentes, así como motivos centrales de glicoproteínas y glicolípidos ligados a N y O de mamíferos, antígenos de carbohidratos asociados a tumores y polisacáridos de bacterias patógenas.
   2. Incubar los portaobjetos en una caja de humedad (humedad relativa ~70%) a temperatura ambiente (25 °C) durante 1 h.
   3. Microarrays de bloqueo: incubar los portaobjetos durante 1,5 h con tampón de bloqueo a temperatura ambiente (100 mM de ácido bórico, 25 mM de etanolamina, 0,2% (v/v) Tween-20 en agua ultrapura).
   4. Lavar el glicochip con agua ultrapura y secarlo al aire.
2. Control de calidad de glicochips
   1. Analice dos microarrays de cada lote utilizando una solución de 1 mg/mL de preparación compleja de inmunoglobulinas (CIP, que contiene inmunoglobulinas: IgG, IgM e IgA), una solución de 10 μg/mL de inmunoglobulinas biotiniladas antihumanas de cabra como anticuerpo secundario (IgM + IgG + IgA), seguida de una solución de 1 μg/mL del conjugado de estreptavidina fluorescente correspondiente (a través del protocolo descrito a continuación, consulte el paso 2).
   2. Escanee y analice los glicochips (consulte el paso 3, análisis de la matriz de glicanos).
   3. Utilice lotes de microarrays con una correlación intra e interchip superior a 0,9.

>2. Técnica de matriz de glicanos

1. Prepare las siguientes soluciones acuosas (en agua ultrapura) y guárdelas a temperatura ambiente (25 °C):
   1. Tampón-1: 1% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1% (v/v) de Tween-20 y 0,01% (p/v) de azida sódica (NaN₃).
   2. Tampón-2: 1% (p/v) de BSA en PBS, 0,1% (v/v) Tween-20 y 0,01% (p/v) de NaN₃.
   3. Búfer-3: 0,1% (v/v) Tween-20 en PBS.
   4. Búfer-4: 0,001% (v/v) Tween-20 en PBS.
2. Glicochip y preparación de muestras
   1. Coloque la caja de almacenamiento con las guías sobre la mesa hasta que alcancen la temperatura ambiente (25 °C).
      nota: Utilice guantes de látex sin polvo. El glicochip debe ser manipulado por la parte inferior del portaobjetos de vidrio, donde se encuentra el código de barras. El código de barras te ayudará a identificar el lado derecho, evitando el contacto con la superficie donde se imprimen los glicanos.
   2. Abra la caja, tome el glicochip y colóquelo en la cámara de incubación (25 °C), ya acondicionada con papel de filtro húmedo para mantener la humedad constante dentro de la cámara.
   3. Mientras tanto, diluya el suero de ratones con Buffer-1 (1:20) en tubos de 1,5 mL. Homogeneizar la solución sérica (5 s) con un mezclador de vórtice.
      nota: El volumen necesario para cubrir totalmente una sola superficie de glicochip es de aproximadamente 1 mL.
   4. Después de la homogeneización, incubar el suero diluido a 37 °C durante 10 min en un baño de agua para evitar la agregación de inmunoglobulinas. Centrifugar los tubos durante 3 min a 10.000 x g y 25 °C, recoger el sobrenadante y desechar el material precipitado.
   5. Coloque el glicochip con cuidado en la cámara de incubación. Incubar durante 15 min a 25 °C con 1 mL de tampón-3 para eliminar cualquier material residual en la superficie del glicochip.
   6. Sostenga el glicochip en posición vertical y vuelva a lavarlo con unas gotas de Buffer-3 utilizando una pipeta Pasteur de plástico. Retire con cuidado el tampón de la superficie del glicochip con papel de filtro.

>3. Reacción: unión de anticuerpos

1. Coloque el glicochip en la cámara de incubación. Extienda la muestra de suero diluida sobre la superficie del glicochip con una micropipeta. Incubar con agitación orbital (30 rpm) a 37 °C durante 1,5 h. Asegúrese de que toda el área seca de la superficie del glicochip esté cubierta por la muestra de suero diluida con la punta de la pipeta.
2. Retire el exceso de muestra y sumerja el glicochip durante 5 minutos en el tampón-3 a 25 °C. A continuación, mueva el glicochip a un recipiente con Buffer-4 (5 min) y finalmente lave (5 min) el glicochip con agua ultrapura. Centrifugar el glicochip durante 1 min a 175 x g y 25 °C para eliminar el líquido.

>4. Detección: anticuerpo secundario

1. Coloque el glicochip en la cámara de incubación. Extender sobre la superficie del glicochip una solución (5 μg/mL) de anti-ratón de cabra (IgG + IgM) conjugada con biotina en Buffer-2. Incubar con agitación orbital (30 rpm) a 37 °C durante 1 h.
2. Retire la fracción libre y repita los pasos de lavado.
3. Después de la centrifugación, incubar el glicochip en oscuridad a 25 °C durante 45 min (30 rpm) con 2 μg/mL de la correspondiente solución de estreptavidina marcada con fluorocromo (en tampón-2).
4. En la oscuridad, retire la fracción libre y repita los pasos de lavado.
5. Secar el glicochip por aire.
   nota: El glicochip debe escanearse lo antes posible. Pero si es imposible hacer la exploración inmediatamente después de la tinción, los glicochips se pueden almacenar en un lugar fresco y seco en la oscuridad.

>3. Análisis de la matriz de glicanos

1. Escanear la matriz
   1. Deje el glicochip en la mesa hasta que alcance la temperatura ambiente en la oscuridad. Al mismo tiempo, encienda el escáner de diapositivas y el láser (longitud de onda de excitación de 633 nm).
   2. Sosteniendo el microarray, deslice el glicochip en la ranura hasta que toque la parte posterior.
   3. Escanee el glicochip ("ejecutar escaneo fácil") y guarde el escaneo como un ". TIFF".

Tabla 1: Lista de glicanos, su unión a los anticuerpos circulantes naturales (IgM + IgG) de ratones BALB/c (n = 20), expresados en unidades de fluorescencia relativa (RFU) como mediana ± MAD, y el número de animales que superan el corte (≥4000 RFU). Esta tabla ha sido reproducida de Bello-Gil, D. et al. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Resultados

Figura 1: Representación esquemática (no a escala) de la configuración, impresión y análisis de la matriz de glicanos.(A) Los microchips impresos se desarrollan con una biblioteca de 419 estructuras de glicanos diferentes, seguidas de la detección con un anticuerpo secundario apropiado marcado con fluorescencia. Cada diapositiva contiene 4 bloques diferentes de sub-matrices (en color...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
anticuerpos
Igs biotinilado de cabra antihumano	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.	Ref. #: 31782
Cabra biotinilada anti-ratón IgM + IgG	Thermo Fisher Scientific	Ref. #: 31807
equipo
Arrayer robótico sciFLEXARRAYER S5	Scienion AG, Berlín, Alemania	http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Bandeja de tinción (cámara de incubación de portaobjetos)	Simport, Beloeil, QC, Canadá	Ref. #: M920-2
centrífuga	Eppendorf, Hamburgo, Alemania	Ref. #: 5810 R
Pipetas	Gilson, Middleton, Wisconsin, Estados Unidos	http://www.gilson.com/en/Pipette/
Escáner de diapositivas	PerkinElmer, Waltham, MA, Estados Unidos	ScanArray GX Plus
Incubadora agitadora	Cole-Parmer, Staffordshire, Reino Unido	Ref. #: SI50
Muestras biológicas
BALB/c sueros de ratones	Este documento	N/ A
Preparación compleja de inmunoglobulinas (CIP)	Immuno-Gem, Moscú, Rusia	http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Productos químicos, reactivos y glicanos
Biblioteca de glicanos	Instituto de Química Bioorgánica (IBCh), Moscú, Rusia	N/ A
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri,	Ref. #: A9418
etanolamina	Sigma-Aldrich	Ref. #: 411000
Preadolescente-20	Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, España	Ref. #: 655204
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	VWR International Eurolab S.L, Barcelona, España	Ref. #: E404
Azida de sodio	Sigma-Aldrich	Ref. #: S2002
Estreptavidina Alexa Fluor 555 conjugado	Thermo Fisher Scientific	Ref. #: S21381
Conjugado de estreptavidina Cy5	GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido	Ref. #: PA45001
materiales
Portaobjetos de vidrio derivados de N-hidroxisuccinimida H	Schott-Nexterion, Jena, Alemania	Ref. #: 1070936
Papel de filtro Whatman	Sigma-Aldrich	Ref. #: WHA10347509
Tubos de 1,5 ml	Eppendorf	Ref. #: 0030120086
Software y algoritmos
Sistema de análisis de microarrays ScanArray Express	PerkinElmer	http://www.per kinelmer.com/microarray