>1. Diseñando la diapositiva de la matriz y el diseño de la placa fuente
- En el encabezado 'Planificar un diseño de diapositivas' en la interfaz de ArrayNinja, haga clic en el enlace que corresponde a la impresora de microarrays que se está utilizando.
nota: ArrayNinja ha sido programado para imitar el movimiento robótico de dos impresoras de microarrays de uso común (ver Tabla 1). La compatibilidad con los otros arreglos se puede configurar a pedido.
- Haga clic dentro del cuadro de diálogo 'Cargar placa', escriba "vacío" y haga clic en 'enter'. Consulte la Figura 1 para ver una captura de pantalla del módulo de diseño ArrayNinja.
- Ajuste el diámetro del punto a 275 μm y el espaciado del punto a 375 μm. Ajuste la configuración restante (Bloques de placa/fila de placa, Filas de placa totales, réplicas, características en y, Super Arrays, SuperA fudge; consulte la Figura 1) para personalizar cómo aparecerán las características en la diapositiva del microarray.
nota: El diámetro del punto está determinado por el tamaño del pin del microarray. A medida que se ajustan estas configuraciones, la diapositiva de dibujos animados se actualizará en tiempo real. Utilice esta caricatura para obtener una vista previa de cómo cada configuración está modificando el diseño final de la diapositiva.
- Una vez finalizado el diseño de las entidades de la diapositiva, pase el ratón por encima de cada entidad única e introduzca el identificador de la entidad en el cuadro de diálogo emergente.
nota: Los identificadores de características pueden consistir en números, letras o combinaciones. Esto solo es necesario para entidades únicas y no aparecerá un cuadro de diálogo cuando se seleccionen réplicas.
- Una vez que se haya asignado un identificador a todas las características únicas, haga clic en 'rellenar'. Ingrese un nombre para el diseño de la diapositiva y haga clic en 'imprimir su placa' para guardar. Se abrirá una nueva página que muestra el número de placas de origen de 384 pocillos necesarias para fabricar el diseño de portaobjetos elegido y una tabla que mapea la ubicación física de cada característica que se cargará en la(s) placa(s) fuente.
nota: Recuerde este nombre, ya que se utilizará para recordar este diseño al analizar datos de microarrays. Al hacer clic en 'imprimir su placa' se guarda el diseño dentro de ArrayNinja.
>2. Fabricación de microarrays
- Preparación de la placa de origen
- Utilice el mapa generado con ArrayNinja para crear la(s) placa(s) fuente(s) de 384 pozos.
NOTA: Las descripciones detalladas de los péptidos consultados en esta plataforma se pueden encontrar en otros lugares.
- Deposite de 1 a 2 μL de cada característica (por ejemplo, péptido de histona biotinilada) en el pocillo correcto de la(s) placa(s) fuente(s) de 384 pocillos.
nota: Los péptidos de histonas biotiniladas se depositan normalmente a partir de soluciones madre de 200 a 400 μM, lo que equivale a un exceso molar de 10 a 25 veces del péptido a los sitios de unión de estreptavidina en un solo punto de la matriz. Esto se calcula usando la ecuación:
donde V es el volumen entregado por un pin, [P] es la concentración de la característica que se está imprimiendo, NA es el número de Avogadro y S es el área de superficie de un punto. C es la cobertura del portaobjetos, expresada como el número de moléculas de estreptavidina por unidad de área multiplicado por tres (el número promedio de sitios de unión de estreptavidina disponibles). V y C son obtenidos por el fabricante respectivo. Otras características pueden requerir diferentes concentraciones dependiendo del tamaño de la biomolécula, donde el apiñamiento puede ser una preocupación. Se debe probar empíricamente un rango de concentraciones de impresión para cada nuevo tipo de característica para determinar la concentración óptima de impresión.
- Diluya cada característica 10 veces con tampón de impresión 1x complementado con albúmina sérica bovina (BSA) al 1%. Gire la(s) placa(s) fuente(s) a 500 x g durante 2 min a temperatura ambiente.
nota: Se recomienda la inclusión de biotina marcada con fluoresceína (5 μg/μL) en el tampón de impresión como control de detección y como ayuda visual para facilitar la alineación adecuada de la matriz durante el análisis (véase la Figura 3).
- Protocolo de impresión (Figura 2A – B).
- Prepare el fabricante vaciando el contenedor de recolección de desechos y llenando el recipiente de la solución de lavado y el recipiente del humidificador con agua destilada estéril.
- Introduzca los parámetros utilizados para diseñar la diapositiva en ArrayNinja (Figura 1) en el programa de control de la impresora de microarrays.
- Usando el programa de control de la impresora de microarrays, configure el procedimiento de lavado para un lavado de 1 s con una inmersión. Establezca los ajustes de poslavado para volver a sumergir los alfileres 5 veces después de cada lavado. Ajuste la humedad al 60%.
nota: La configuración de lavado óptima puede variar en función de la impresora de microarrays que se utilice. La configuración óptima de la inmersión de los pines de poslavado puede variar en función de la impresora de micromatrices que se utilice.
- Inserte portaobjetos funcionalizados (por ejemplo, vidrio recubierto con estreptavidina) en las platinas de sustrato y coloque todas las platinas en el elevador de placas. Inserte la(s) placa(s) fuente(s) en el(los) soporte(s) de placas y colóquelas en el elevador de placas fuente.
- Haga clic en 'imprimir'. Supervise el proceso de impresión durante algunas rondas de deposición de características para asegurarse de que todos los ajustes de lavado y inmersión sean correctos. Una vez finalizada la tirada de impresión, retire las placas de sustrato del arrayer.
nota: Cuando las tiradas grandes impiden completar los pasos de bloqueo en un día, las diapositivas impresas pueden incubarse en una cámara humidificada a 4 °C durante la noche. Incuba los portaobjetos junto a un pequeño vaso de agua dentro de una caja de cartón sellada con una envoltura de plástico.
- Bloquee los portaobjetos con un tampón de bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente con mezcla.
- Lave los portaobjetos 2 x 10 min a temperatura ambiente en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,6 con mezcla. Seque los portaobjetos girándolos en una centrífuga de portaobjetos de microarray durante 30 s a temperatura ambiente.
nota: Para procesar un gran número de portaobjetos a la vez, se puede utilizar una cámara de lavado de portaobjetos de microscopio de alto rendimiento, lo que permite lavar 50 portaobjetos en paralelo.
- Para los portaobjetos diseñados para ser particionados con cera, proceda a la sección 2.1. Para todos los demás diseños, guarde las guías a 4 °C protegidas de la luz y la humedad.
nota: Los péptidos de histonas biotiniladas impresos son estables durante al menos 6 meses cuando se almacenan de esta manera.
>2. Particionar portaobjetos de microarrays
- Pluma de cera hidrofóbica (Figura 2C)
- Aplique cera alrededor de las áreas que contienen rasgos con un bolígrafo de cera. Deje que la cera se seque al aire durante 5 minutos antes de continuar con la sección 3.
nota: Después del bloqueo, los puntos de la matriz pueden ser muy difíciles de visualizar a simple vista. El diseño de portaobjetos de ArrayNinja se puede imprimir a escala y utilizar como guía para aplicar cera.
- Junta de silicona (Figura 2D)
- Pegue la película transparente de la parte posterior de la junta de la matriz y coloque el lado adhesivo hacia abajo en el portaobjetos de la matriz de micromatriz.
- Mantenga la junta en su lugar durante 5 segundos antes de continuar con la sección 3.
- Impresión de cera (Figura 2E)
- En el caso de los portaobjetos diseñados para ser particionados por cera, imprima un portaobjetos de prueba en vidrio liso utilizando un 10% de BSA. Utilice este portaobjetos de prueba para optimizar las guías de impresión de cera o la configuración de la matriz para asegurarse de que todas las características estén dentro de las cámaras de molde de cera.
- Calentar la impresora de cera microarray a 85 °C hasta que toda la cera se derrita por completo, aproximadamente 30 min.
- Inserte la diapositiva con la cara impresa hacia abajo y empuje la diapositiva hasta la guía derecha de la impresora de microarrays. Tire hacia arriba de la palanca para que el molde entre en contacto con la superficie de la guía. Mantener durante 2 s.
nota: El tiempo de retención se puede modificar para lograr un grosor óptimo del borde de cera.
- Retire rápidamente el portaobjetos e inspeccione visualmente los bordes de cera para asegurarse de que todos los pozos estén cerrados y que los bordes no sean tan gruesos que invadan los lugares. Guarde los portaobjetos a 4 °C protegidos de la humedad y la luz.
nota: El tiempo de retención se puede aumentar o disminuir para obtener bordes más gruesos o más delgados.
>3. Hibridando un anticuerpo PTM de histonas con un microarray de péptidos
- Prepare el tampón de hibridación (PBS, pH 7.6, 5% BSA, 0.1% Tween-20).
- Equilibre el deslizamiento en el tampón de hibridación utilizando un recipiente de hibridación. Cubrir completamente todo el portaobjetos con tampón de hibridación e incubar durante 30 min a 4 °C en un agitador orbital a baja velocidad.
- Prepare una solución que contenga un anticuerpo PTM de histona diluido en tampón de hibridación.
nota: En los datos de ejemplo, tanto el anticuerpo de histona #1 como el anticuerpo #2 se diluyeron 1:1.000 en tampón de hibridación. Se recomienda como punto de partida un intervalo de dilución similar al utilizado para la inmunotransferencia.
- Incubar la matriz con la solución de anticuerpos durante 1 h a 4 °C. Retirar la solución de anticuerpos y lavar la matriz 3 veces durante 5 min a 4 °C con PBS frío, pH 7,6.
- Prepare una dilución 1:5.000 - 1:10.000 de anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente en tampón de hibridación.
- Incubar la matriz con una solución de anticuerpos secundaria durante 30 min a 4 °C protegida de la luz. Retire la solución de anticuerpos secundarios y lave el portaobjetos del microarray 3 veces durante 5 min a 4 °C con PBS, pH 7,6. Sumerja el microarray en un tubo cónico de 50 ml que contenga 0,1x PBS, pH 7,6 para eliminar el exceso de sal a temperatura ambiente. Seque el portaobjetos en una centrífuga de portaobjetos de microarray a temperatura ambiente.
- Escanee el portaobjetos con un escáner de microarrays con una resolución de 25 μm o superior, siguiendo el protocolo de escaneo recomendado por el fabricante del escáner de microarrays.
nota: Si hay un trazador de biotina marcado con fluoresceína, escanee tanto el canal verde (por ejemplo: 488 nm, em: 509 nm) como el canal que corresponde al anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente, generalmente rojo (por ejemplo: 635 nm, em: 677 nm). El objetivo del escaneo es obtener archivos de .tif de un solo canal que se puedan fusionar en un solo archivo .png.
