Inmunolocalización de proteínas arabinogalactanos y pectinas en tejido vegetal

Resumen

Fuente: Costa, M., et al. Inmunolocalización fluorescente de proteínas arabinogalactanos y pectinas en la pared celular de tejidos vegetales. J. Vis. Exp. (2021).

Este video muestra una técnica de inmunotinción para localizar proteínas arabinogalactanos (AGPs) y pectinas en tejidos vegetales. Las secciones de tejido vegetal fijas e incrustadas en resina se tiñen con anticuerpos primarios y secundarios fluorescentes específicos de AGP y pectina y un colorante fluorescente que se une a la celulosa para revelar su colocalización específica del tejido en la pared celular.

Protocolo

1. Inmunolocalización

NOTA: El procedimiento de inmunolocalización fluorescente se basa en el uso secuencial de dos anticuerpos. El anticuerpo primario se genera contra un antígeno diana específico. El anticuerpo secundario se eleva específicamente contra el anticuerpo primario y, para las técnicas fluorescentes, se conjuga con un fluoróforo (FITC [isotiocianato de fluoresceína] en este protocolo específico). El anticuerpo primario se utilizará para detectar el antígeno objetivo en la muestra, y el anticuerpo secundario se utilizará para marcar la ubicación donde el anticuerpo primario se conectó a la muestra después de lavar el exceso de anticuerpo primario. Los controles son una parte importante de este ensayo y siempre deben realizarse para asegurar la precisión de las observaciones. Un pocillo en el portaobjetos debe reservarse para su uso como control negativo, donde se omitirá el tratamiento primario con anticuerpos y, por lo tanto, no se debe observar ninguna señal al final del experimento. Se debe incluir un control positivo en el experimento mediante el tratamiento de un bien con un anticuerpo cuyo marcaje ya se conoce y es seguro. El control positivo se utiliza para confirmar la eficacia del marcaje de anticuerpos secundarios y las condiciones de reacción, mientras que el control negativo prueba la especificidad del anticuerpo secundario.

1. Prepare una cámara de incubación colocando algunas toallas de papel humedecidas en el fondo de una caja de puntas de pipeta y envolviéndola con papel de aluminio (Figura 1B-1E). Coloque los portaobjetos en la cámara de incubación.
2. Pipetear una gota de 50 μL por pocillo de 8 mm de solución de obstrucción (leche en polvo descremada al 5% (p/v) en solución salina tamponada con fosfato 1 M [PBS]) e incubar durante 10 min. Retirar la solución de bloqueo y lavar todos los pocillos dos veces con PBS durante 10 min.
3. Prepare las soluciones de anticuerpos primarios (ver Tabla 1), anticuerpo 1:5 (v/v) en solución de bloqueo; haga una estimación de aproximadamente 40 μL por pocillo de 8 mm.
   nota: La concentración del anticuerpo debe ajustarse de acuerdo con el protocolo del fabricante.
4. Realizar un lavado final con agua bidestilada (ddH₂O) durante 5 min, nunca dejar secar los pocillos por completo.
5. Pipetear la solución de anticuerpo primario a los pocillos de reacción. Solución de bloqueo de pipetas a los pozos de control.
6. Cerrar la cámara de incubación y dejar reposar durante 2 h a temperatura ambiente, seguido de toda la noche a 4 °C. Preparar la solución de anticuerpos secundarios, al 1% en solución de bloqueo (v/v) unos 40 μL por pocillo. Manténgalo cubierto con papel de aluminio.
7. Lave todos los pocillos dos veces con PBS durante 10 minutos, seguidos de 10 minutos adicionales con ddH₂O. Asegúrese de que no haya rastros visibles de la solución de bloqueo o depósitos en los pocillos.
8. Pipetear la solución de anticuerpo secundario a todos los pocillos. A partir de ahora, proteja las correderas de la luz.
9. Incubar durante 3-4 h en la oscuridad a temperatura ambiente.
10. Lave todos los pocillos dos veces durante 10 min con PBS seguido de otro lavado de 10 min con ddH₂O.
11. Aplique una gota de calcofluor (1:10.000 (p/v) fluorescente brillante 28 en PBS) a cada pocillo. Sin lavar, aplique una gota de medio de montaje (consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo y coloque un cubreobjetos (Figura 2H).
12. Observar con un microscopio de fluorescencia, equipado con lentes 10x/0.45, 20x/0.75, 40x/0.95 y 100x/1.40, utilizar filtros UV (para tinción de calcofluor) y FITC, para detectar la pared celular y la inmunolocalización respectivamente (Figura 2I). Utilice las siguientes longitudes de onda: excitación/emisión (nm) 358/461 para UV y 485/530 para FITC.
13. Para una mejor visualización de los resultados, superponga ambas imágenes con ImageJ o similar.

Tabla 1: Lista de anticuerpos monoclonales útiles. La tabla anterior representa un ejemplo de anticuerpos disponibles, con información sobre sus objetivos y dónde se pueden comprar.

nombre	afinidad	Disponible en
LM2	Proteína de arabinogalactano	Sondas de planta (Leeds, Reino Unido)
LM5	pectinas
LM6	Arabinan
LM7	Homogalacturonano
LM8	Xilogalacturonano
LM13	(1-5)-a-L-ARABINAN
LM14	Proteína de arabinogalactano
LM16	Arabinan procesado - RG-I
LM18	Homogalacturonano
LM19	Homogalacturonano
LM20	Homogalacturonano
LM26	GALACTÁN RAMIFICADO
LM30	Proteína de arabinogalactano
JIM5	Homogalacturonano con bajo contenido de metilesterificado	CCRC (Georgia, EE.UU.)
JIM7	Homogalacturonano altamente metilesterificado
JIM4	Proteína de arabinogalactano
JIM8	Proteína de arabinogalactano
JIM13	Proteína de arabinogalactano
JIM15	Proteína de arabinogalactano
JIM16	Proteína de arabinogalactano
JIM20	Extensin
MAC207	Proteína de arabinogalactano

Resultados

Figura 1. (A) Representación esquemática de la secuencia de recorte de bloques para preparar la muestra (bloque amarillo) para el corte con el ultramicrótomo. En primer lugar, se retira la cápsula de gelatina (1). A continuación, primero se recortan en un ángulo de 40° a 45° con respecto a los lados de la cápsula tangencialmente a la muestra (2), se realiza un segundo corte a 90° del primero (3) segu...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
8 pocillos Portaobjetos de reacción de vidrio	Marinfeld	MARI1216750	Se pueden utilizar otras marcas
Producción de anticuerpos anti-IgG (molécula wole)-FITC en cabra	Sigma-Aldrich	F6258
Cubreobjetos, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	El cubreobjetos debe cubrir todos los pocillos. Se pueden utilizar otras marcas
ddH2O	Na	Na
Absoluto de etanol	Na	Na
Abrillantador fluorescente 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Leche en polvo descremada	Nestlé	Na	Cualquier leche en polvo descremada es adecuada
horno	Na	Na	horno de laboratorio genérico
Anticuerpo monoclonal generado por ratas	Sondas de planta	Na	Varios anticuerpos que reconocen los componentes de la pared celular están disponibles tanto en el centro de investigación de carbohidratos complejos (CCRC, Universidad de Georgia, EE. UU.) como en Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, en la Universidad de Leeds, Reino Unido). En la Tabla Suplementaria 1 se presenta una breve lista de algunos MABS de uso común y dónde se pueden comprar
Microscopio de epifluorescencia vertical con filtros de fluorescencia UV y FITC	Microsistems Leica	DMLb
Cámara de vacío	Na	Na
vacío	Na	Na
Vectashield	Laboratorios vecta	T-1000	Se pueden utilizar otros anti-desvanecimiento. Compruebe la compatibilidad con FITC y el abrillantador fluorescente 28. (Nota: para una alternativa no comercial, (ver Jonhson et al 198218) Se puede hacer un medio antidecoloración mezclando 25 mg/mL de 1,4-Diazobiciclo-(2,2,2)octano (DABCO) en glicerol 9:1 (v/v) a 1xPBS. Ajuste el pH a 8.6 con HCl diluido).

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