Uso de un ELISA sándwich para determinar el contenido de glicoproteínas inmunogénicas en una vacuna

Resumen

Fuente: Jallet, C. et al., Prueba ELISA in vitro para evaluar la potencia de la vacuna antirrábica.J. Vis. Exp. (2020)

Este video muestra un ensayo de inmunoabsorción indirecta ligado a enzimas o un ensayo de inmunocaptura en sándwich ELISA diseñado para evaluar los niveles de glicoproteínas inmunogénicas en vacunas. La placa de ensayo, que contiene anticuerpos específicos de glicoproteína, se incuba con muestras de vacunas diluidas en serie, incluidas las vacunas de referencia y de prueba, seguidas de un inmunoensayo para cuantificar el contenido de glicoproteínas en la vacuna de prueba.

Protocolo

1. Precauciones de seguridad

NOTA: Este método es aplicable tanto al virus vivo de la rabia (RABV) como a la vacuna inactivada.

1. Utilizar las buenas prácticas de laboratorio y los procedimientos de seguridad.
2. Use equipo de protección personal (EPP) adecuado, incluido abrigo desechable, guantes, mascarillas, gafas, etc.
3. Cuando se valore el virus vivo, utilice una cabina de seguridad biológica de clase II.
   1. Considere cualquier material en contacto con las muestras (reactivos, soluciones de lavado, etc.) como material infeccioso.
   2. Tratar el material contaminado sumergiéndolo en la solución de lejía (2,5% de hipoclorito de sodio) durante 30 minutos para su descontaminación.
4. Manejar los productos químicos de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio.

2. Preparación

1. Utilice reactivos de grado analítico siempre que sea posible.
2. Prepare soluciones frescas del tampón de recubrimiento/tampón de carbonato, tampón de pasivación, diluyente y tampón de citrato (Tabla 1), filtre a través de filtros de 0,45 o 0,22 μm y almacene a 4 °C durante un día antes de su uso para preservar su pureza analítica.
3. Deje que los reactivos alcancen la temperatura ambiente (+18 °C a +25 °C) 30 minutos antes de su uso y homogeneice mezclándolos suavemente antes de su uso.

3. Sensibilización de microplacas

>NOTA: Utilice placas de inmunoensayo de adsorción de 96 pocillos que están optimizadas para unirse a grandes cantidades de inmunoglobulinas (por ejemplo, consulte la Tabla de Materiales).

1. A cada pocillo, añadir 200 μL del anticuerpo monoclonal (mAb-D1) diluido en el tampón de carbonato.
   nota: Se ha determinado experimentalmente una concentración óptima de aproximadamente 1 μg/mL y corresponde a una dilución aproximada de 1/2000 del mAb-D1 purificado. Esta concentración recomendada está indicada para cada lote de mAb-D1 y debe ser verificada periódicamente con el control positivo.
2. Cubra la placa con una película adhesiva e incube la microplaca durante 3 h a 37 °C en una atmósfera humidificada.
3. Aspire cuidadosamente y transfiera el contenido del pocillo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 2,5%.
4. Invierte la microplaca y déjala secar sobre un papel absorbente a temperatura ambiente durante 5 min.

4. Pasivación de microplacas

1. A cada pocillo, agregue 300 μL del tampón de pasivación.
2. Cubrir la placa con una película adhesiva e incubar durante 30 min a 37 °C.
3. Aspire con cuidado y transfiera el contenido del pocillo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 2,5%.
4. Invierta la microplaca y déjela secar sobre un papel absorbente a temperatura ambiente durante 1 min.
   nota: La microplaca puede utilizarse inmediatamente o almacenarse sellada a -20 °C durante un máximo de 3 meses hasta su uso.

5. Ensayo ELISA

NOTA: Para establecer la curva de control de la vacuna de referencia, no se requiere el Paso 5.3; para valorar la vacuna probada son necesarios todos los Pasos 5.1 a 5.6.

1. Lavado de la microplaca sensibilizada
   1. A cada pocillo, añadir 300 μL del tampón de lavado.
   2. Aspire con cuidado y transfiera el contenido del pocillo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 2,5%.
   3. Repita los pasos 5.1.1 y 5.1.2 cinco veces más para lavar abundantemente la placa sensibilizada.
   4. Invierta la microplaca y déjela secar sobre un papel adsorbente a temperatura ambiente durante 1 min.
2. Diluciones de la vacuna de referencia para la curva de control
   1. Reconstituir la vacuna de referencia (antígeno de validación, lote 09) en 1 mL de agua destilada, correspondiente a una concentración de 10 μg/mL de glicoproteína del virus de la rabia.
   2. Prepare una dilución diez veces mayor de la vacuna de referencia reconstituida en el diluyente para alcanzar 1 μg/ml de glicoproteína del virus de la rabia.
   3. Prepare 6 diluciones seriadas dobles de esta vacuna de referencia en el diluyente como se indica en la Tabla 1.
   4. Distribuya 200 μL del diluyente por duplicado (pocillos 1H/2H) para que sirva como control en blanco.
   5. Distribuir 200 μL por pocillo de cada dilución de vacuna de referencia por duplicado (pocillos G1/G2 a A1/A2).
3. Diluciones de la vacuna ensayada para su titulación
   1. Prepare una dilución diez veces mayor de la vacuna probada en el diluyente.
   2. Prepare 7 diluciones seriadas dobles de la vacuna probada en diluyente como se indica en la Tabla 2.
   3. Distribuya 200 μL por pocillo de cada dilución de vacuna analizada por duplicado (pocillos H3/H4 a A3/A4).
4. Incubación/lavado de la placa ELISA
   1. Cubrir la microplaca con una película adhesiva e incubar durante 1 h a 37 °C.
   2. Retire la película, aspire con cuidado y transfiera el contenido de cada pocillo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 2,5%.
   3. A cada pocillo, añadir 300 μL de tampón de lavado.
   4. Aspirar con cuidado y transferir el contenido de cada pocillo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 2,5%.
   5. Repita los pasos 5.4.3 y 5.4.4 cinco veces para eliminar el antígeno no unido y conservar los trímeros de proteína G unidos al anticuerpo recubierto (mAb D1).
   6. Invierte la microplaca y déjala secar sobre un papel absorbente a temperatura ambiente durante 1 min.
5. Unión de la peroxidasa conjugada mAb-D1
   1. Distribuir 200 μL por pocillo de la dilución recomendada (1/2000) de mAb-D1 marcado con peroxidasa en diluyente (concentración aproximada de 1μg/mL). Se indica una concentración recomendada para cada lote de mAb-D1 y debe verificarse periódicamente con el control positivo.
   2. Cubrir la microplaca con una película adhesiva e incubar durante 1 h a 37 °C.
   3. Retire la película, aspire con cuidado y transfiera el contenido de cada pocillo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 2,5%.
   4. Añadir a cada pocillo, 300 μL del tampón de lavado.
   5. Aspirar con cuidado y transferir el contenido de cada pocillo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 2,5%.
   6. Repita los pasos 5.5.4 y 5.5.5 cinco veces para eliminar el anticuerpo marcado con peroxidasa no unido (mAb D1).
   7. Invierte la microplaca y déjala secar sobre un papel absorbente a temperatura ambiente durante 1 min.
6. Revelación usando un sustrato-cromógeno
   1. Distribuya 200 μL por pocillo de solución de sustrato-cromógeno.
   2. Selle la microplaca con una película e incube en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se desarrolla un color amarillo-anaranjado cuya intensidad es proporcional a la cantidad de anticuerpos marcados con peroxidasa unidos (mAb D1).
   3. Detenga la reacción añadiendo 50 μL de solución de parada por pocillo.
   4. Limpie cuidadosamente la parte inferior de la microplaca y colóquela en un espectrofotómetro para determinar la densidad óptica (DO) a 492 nm de todos los pocillos utilizados: control negativo (en blanco), vacuna de referencia y vacuna probada.
   5. Recopile datos de OD en formato de archivo .xls o .xlsx para su análisis.

Tabla 1. Tampones utilizados en el ensayo.

Tampones y reactivos	preparación
Tampón de recubrimiento (Tampón de carbonato: 50 mM, pH = 9,6)	Agregue carbonato de sodio 50 mM (Na2CO 3-10H2O) al bicarbonato de sodio 50 mM (NaHCO3) hasta el pH deseado (aproximadamente 1/10 volumen de bicarbonato de sodio)
Búfer de pasivación	0,3% Albúmina sérica bovina (BSA, fracción V), 5% sacarosa en tampón de carbonato 50 mM pH 9,6
10x Solución salina tamponada con fosfato pH=7 (PBS 10x)	NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2PO 4-12H2O 11,33 g, KH2PO4 2g en 1L de agua destilada. Ajuste el pH = 7 con 4N NaOH
Tampón de lavado	0.05% Tween en 1x PBS
diluyente	0,5% albúmina sérica bovina (fracción V), 0,05% Tween en 1x PBS (ajustar el pH a 7 debido a la acidificación por BSA)
Tampón de citrato pH-5.6 (para sustrato de peroxidasa)	11,67 g Citrato trisódico-2H2O (Na3C6H5O7-2H 20), 2,17 g Ácido cítrico-1H20 en 1L de agua destilada
Solución de sustrato-cromógeno	50 mg Ortho-fenilendiamina comprimido, 0,1% Peróxido de hidrógeno 30% (110 vol) en 25 ml Tampón citrato pH 5,6
Solución de parada (Ácido sulfúrico 4N)	10 ml de H2SO4 36N en 80 ml de agua destilada enfriada. La dilución debe realizarse en un baño de hielo

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cabina de seguridad biológica de clase II	ThermoFisher Scientific	10445753	Si se titula un virus en vivo
Placas transparentes de fondo plano Immuno no estériles de 96 pocillos, 400 μL, MAXISORP	ThermoFisher Scientific	439454	Bueno para unirse al anticuerpo cargado
Equip Labo Campana de Polipropileno de Laboratorio	ThermoFisher Scientific	12576606	Para la preparación de ácido sulfúrico
placa de inmunología strong Adsorción MAXISORP Fondo Plano Pozo F96	Dutscher	55303	Bueno para unirse al anticuerpo cargado
Cinta de sellado de microplacas (100 hojas)	ThermoFisher Scientific	Año 15036
Lector monomodo de microplacas Sunrise	TECAN
Agitador-incubador de microplacas	Dutscher	441504
Lavadora de microplacas Wellwash	ThermoFisher Scientific	5165000
Pipeta multicanal (30-300 μL) 12 canales	ThermoFisher Scientific	4661180N
Pipetas monocanal (Kit 2 : Finnpipettes F2 0,2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL y 100-1000 μL)	ThermoFisher Scientific	4700880