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1. Acoplamiento de Nanopartículas Magnéticas (MNPs)
- Utilice el procedimiento de acoplamiento comercial y los reactivos para acoplar MNP con anticuerpos (Abs) (generalmente 1 mg). Se utilizan nanopartículas de óxido de hierro con ácido carboxílico como grupos reactivos.
- Si los anticuerpos tienen un volumen superior a 0,5 ml, concéntrelo con un concentrador de 100K. Girar a 2.000 x g durante 3-5 min.
- Al final del procedimiento, después de añadir 10 μl del tampón de enfriamiento, transfiera los MNP a un tubo de 12 mm x 75 mm y añada 3 ml de tampón de lavado/almacenamiento. Coloque el tubo en el orificio central de un separador magnético y déjelo toda la noche a 4 °C.
- Verifique que todos los MNP se hayan acumulado a un lado del tubo y luego pipetee cuidadosamente todo el líquido. Agregue 3 ml de tampón de lavado/almacenamiento fresco y vuelva a colocar en el imán.
- Después de varias horas, verifique si las MNP se recogen al costado del tubo y luego pipetee el líquido. Utilice 2 ml de tampón de lavado/almacenamiento para volver a suspender los MNP y almacene a 4 °C.
- Verificar que los Abs están acoplados a las MNP marcándolas con un fragmento de anticuerpo Fab fluorescente pertinente (por ejemplo, anti-ratón de cabra si se utiliza un Ab monoclonal de ratón para la captura, como se describe en la sección 2) y ejecutarlo en un citómetro de flujo.
>2. Marcaje de anticuerpos acoplados a MNPs
- Combine 60 μl (3,9 x10 12 partículas) de MNPs (por condición) y 5 μl (de una solución comercial de 200 μg/ml) de fragmentos de Fab marcados, específicos para el isotipo del Ab de captura en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 30 min con mezcla continua.
- Prehumedecer un concentrador de 100K con 300 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y centrifugar en una microcentrífuga a 1.500 x g durante 5 min.
- Purifique los complejos marcados en una columna de 100K. Centrifugar la mezcla del paso 2.2 en una microcentrífuga a 1.500 x g durante 5 min, lavar con 200 μl de PBS y recuperar en el volumen inicial.
>3. Uso de complejos Ab-MNP marcados para capturar partículas de interés (vesículas extracelulares, EVs)
- Incubar MNPs premarcados de 60 μl (3,9 x10 12 partículas) con preparación EV (100 μl).
- Prepare las preparaciones de EV utilizando varios métodos. Aquí, purifique los EV en gradientes de sacarosa, recójalos de plasma pobre en plaquetas utilizando reactivos de precipitación de exosomas o aísle directamente del plasma.
nota: Las proporciones óptimas deben determinarse para cada experimento y dependen de la concentración de EV en la preparación. La fracción MNP-Ab debe ser ~106 en exceso en comparación con la concentración de la fracción EV.
- Incubar 1 hora a 4 °C para vehículos eléctricos.
- Agregue 2.5% de IgG de ratón / IgG humana para bloquear la unión de Fc, vórtice suavemente, incube de 3 a 5 minutos en RT.
- Agregue las concentraciones recomendadas o tituladas por el fabricante de cada Abs de detección e incube 20 minutos adicionales en RT.
>4. Separación de los EVs capturados por MNP de los anticuerpos no unidos mediante columnas magnéticas
- Prepare la columna de separación magnética para su uso colocándola en un imán separador.
- Humedecer previamente la columna con 500 μl de tampón de lavado (2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS). Permita que el tampón de lavado fluya a través de la columna.
- Agregue los complejos MNP-EV a la columna y permita que todo el líquido fluya a través de ellos. Añada 500 μl de tampón de lavado a la columna, permitiendo el paso de todo el volumen.
- Repita el lavado con tampón de lavado 2 veces más.
- Retire la columna del imán y colóquela en un tubo de 12 mm x 75 mm para recoger los complejos MNP-EV retenidos. Deje que la columna permanezca en el tubo fuera del imán durante 3 minutos. Añadir 200 μl de PBS y dejar que las perlas fluyan hacia abajo por gravedad, añadir otros 200 μl de PBS, y fijar con 200 μl de paraformaldehído al 4% después de la elución.
nota: Se sospecha que el paraformaldehído es cancerígeno y debe manipularse con una capucha ventilada y se deben usar guantes.
- Para cuantificar EV individuales, utilice la configuración volumétrica en el muestreador de alto rendimiento (HTS) o, justo antes de la adquisición, agregue perlas de recuento de citometría de flujo bien mezcladas.
>5. Análisis de EVs capturados por MNPs con un citómetro de flujo
- Calentar el citómetro de flujo durante 30 min.
- Ejecute cuentas de control de calidad.
- Establezca el umbral de fluorescencia de MNP o EV marcados. Utilice PBS filtrado de 0,22 μm para el umbral para disminuir el "ruido" de fondo. Establezca el umbral ajustando el voltaje PMT al nivel en el que el PBS filtrado no da eventos, o muy pocos.
- Ejecute muestras a bajo rendimiento. (Utilice un filtro en línea adicional de 0,04 μm para el fluido de la vaina colocado en serie detrás del filtro de vaina estándar de 0,2 μm para eliminar aún más los eventos falsos).