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1. Preparación de muestras biológicas
NOTA: El sitio anatómico elegido y el volumen de la extracción de sangre se dejan a discreción de cada investigador individual y no afectarán el resultado del ensayo. Sin embargo, una vez que se obtienen, las muestras deben manipularse de acuerdo con los pasos que se enumeran a continuación.
- Preparación de muestras de suero
- Recoja el volumen deseado de sangre en el tubo de recolección preferido y deje que coagule durante al menos 30 minutos.
- Centrifugar la muestra durante 10 min a 1.000 x g a temperatura ambiente.
- Extraer el suero y el ensayo inmediatamente o alícuota en tubos de microcentrífuga de polipropileno y almacenar las muestras a ≤ -20 °C.
- Preparación de muestras de plasma
- Recoja el volumen deseado de sangre utilizando tubos de extracción de sangre recubiertos de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
- Centrifugar durante 10 min a 1.000 x g a temperatura ambiente dentro de los 30 min posteriores a la recolección.
- Extraer el plasma y el ensayo inmediatamente, o alícuota en tubos de microcentrífuga de polipropileno y almacenar las muestras a ≤ -20 °C.
- Preparación de muestras de sobrenadante para cultivo de tejidos
- Centrifugar la muestra durante 10 minutos a 1.500 x g a 4 °C para eliminar las células y los residuos.
- Recoja el sobrenadante y ensaye inmediatamente o alícuotas en tubos de microcentrífuga de polipropileno y almacene a ≤ -20 °C.
- Descongelación de muestras biológicas congeladas
- Descongele completamente cualquier muestra biológica previamente congelada en hielo y vórtice brevemente antes de usar. Evite más de 2 ciclos de congelación/descongelación.
nota: Las muestras utilizadas en este protocolo se obtuvieron mediante el cultivo de esplenocitos de ratón BALB/c (1 x 106 células a 37 °C + 5% de CO2 en diversas condiciones: no estimuladas, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 μg/mL recubiertas en placa) + αCD28 (1 μg/mL soluble), PMA (20 ng/mL) + Ionomicina (500 ng/mL). Los sobrenadantes de cultivo se recolectaron después de 48 h y se procesaron como se describe en la sección 1.3.
>2. Preparación de reactivos
- Preparación de perlas premezcladas inmovilizadas con anticuerpos
- Sonicar el frasco de perlas premezcladas durante 1 minuto en un baño de sonicador a temperatura ambiente, y luego vórtice durante 30 s antes de su uso. Si no se dispone de un baño de sonicador, aumente el tiempo de vórtice a 1 min.
- Preparación del tampón de lavado
- Lleve el tampón de lavado 20x (20x PBS con 1% Tween-20) suministrado con el kit a temperatura ambiente y vórtice para llevar todas las sales a la solución.
- Diluya 25 mL de tampón de lavado 20x con 475 mL de agua desionizada. Almacene las porciones no utilizadas entre 2 °C y 8 °C hasta por un mes.
- Preparación de la matriz B (solo para uso con muestras de suero y plasma)
- Agregue 5.0 mL del tampón de ensayo (PBS con 1% de BSA) incluido en el kit al frasco que contiene la matriz B liofilizada. Espere al menos 15 minutos para la reconstitución completa, luego el vórtice para mezclar bien. Los restos de Matrix B reconstituida pueden almacenarse a ≤ -70 °C hasta un mes.
>3. Preparación estándar
NOTA: Cada analito en este panel tiene una concentración estándar máxima de 10,000 pg/mL.
- Añada 250 μL de tampón de ensayo para reconstituir el cóctel estándar de citocinas Th de ratón liofilizado. Mezcle mediante un breve vórtice y deje reposar el vial a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Transfiera el cóctel estándar a un tubo de microcentrífuga de polipropileno etiquetado como "C7". Esto se utilizará como el estándar superior.
- Etiquete 6 tubos de microcentrífuga de polipropileno como C6, C5, C4, C3, C2 y C1.
- Añada 75 μL de tampón de ensayo a cada uno de estos tubos.
- Transfiera 25 μL del estándar superior C7 al tubo C6 y mezcle bien mediante vórtice. Este será el estándar C6.
- Continúe realizando diluciones en serie 1:4 utilizando una nueva punta de pipeta para cada tubo para agregar 25 μL del estándar anterior a los 75 μL de tampón de ensayo en el siguiente tubo estándar más bajo, seguido de vórtice para obtener los estándares C5, C4, C3, C2 y C1. Utilice el tampón de ensayo como estándar de 0 pg/mL (C0).
>4. Dilución de la muestra
NOTA: Es posible que se requieran experimentos piloto preliminares que utilicen este ensayo con múltiples diluciones para determinar el factor de dilución más apropiado para un conjunto particular de muestras biológicas. Un factor de dilución adecuado producirá cálculos de concentración para la muestra que se encuentran dentro de los límites de la curva estándar. Los siguientes pasos son orientativos y pueden tener que determinarse empíricamente en función del tipo de muestra.
- Diluya muestras de suero o plasma 2 veces con tampón de ensayo (por ejemplo, diluya 50 μL de muestra con 50 μL de tampón de ensayo) en tubos de microcentrífuga de polipropileno.
nota: Si se requiere una dilución adicional de la muestra, las diluciones deben realizarse con la matriz B en lugar de con tampón de ensayo para garantizar una medición precisa. La adición de muestras de suero o plasma sin dilución dará como resultado una baja precisión del ensayo y puede obstruir la placa del filtro. La matriz B está compuesta por suero de ratón agrupado sin objetivos de ensayo endógenos. Se utiliza como diluyente de muestras de suero o plasma para evitar los efectos de la matriz, que se sabe que afectan a la sensibilidad analítica de los inmunoensayos.
- Analice muestras de sobrenadantes de cultivos celulares sin dilución.
nota: Los niveles de analito pueden variar mucho de una muestra a otra. Si es necesario, diluya las muestras de sobrenadante utilizando una nueva preparación de su medio de cultivo celular correspondiente o tampón de ensayo.
5. Procedimiento de ensayo
NOTA: El ensayo se puede realizar en placas de filtro de polipropileno, tubos de clasificación de células activadas por microfluorescencia (FACS) o microplacas de fondo en V. Se recomienda el procedimiento de ensayo de placa filtrante debido a la buena consistencia de muestra a muestra, la solidez del ensayo y la facilidad de manejo. Este procedimiento requiere una unidad de filtración al vacío para el lavado (proporcionada por el usuario final).
- Deje que todos los reactivos se calienten a temperatura ambiente (20 - 25 °C) antes de usar.
- Coloque la placa del filtro en una cubierta de placa invertida en todo momento durante la configuración del ensayo y los pasos de incubación para que la parte inferior de la placa no toque ninguna superficie, ya que puede causar fugas.
- Mantenga la placa en posición vertical durante todo el procedimiento de ensayo, incluidos los pasos de lavado, para evitar la pérdida de cordones.
- Mantenga la placa en la oscuridad o envuelta con papel de aluminio para todos los pasos de incubación.
- Ejecute todos los estándares y muestras como duplicados dispuestos en la placa en un orden secuencial.
- Humedezca previamente la placa de filtro agregando 100 μL de 1x tampón de lavado a cada pocillo y déjela reposar durante 1 minuto a temperatura ambiente (si usa microplaca de fondo de filtro).
- Elimine el volumen del tampón utilizando el colector de vacío (5 - 10 s). No exceda los 10 " Hg de vacío. Seque el exceso de tampón de lavado de la parte inferior de la placa presionando la placa sobre una pila de toallas de papel limpias. Coloque la placa encima de la cubierta de la placa invertida.
nota: Los pasos 5.1 a 5.2 pueden omitirse si el ensayo se realiza utilizando una microplaca de fondo en V o tubos micro FACS.
- Para muestras de sobrenadante de cultivo celular, agregue 25 μL de tampón de ensayo a todos los pocillos. Agregue 25 μL de cada patrón a los pocillos estándar. Añada 25 μL de cada muestra a los pocillos de muestreo.
- Para medir muestras de suero o plasma, agregue 25 μL de Matrix B a los pocillos estándar. Añada 25 μL de tampón de ensayo a los pocillos de muestra. Agregue 25 μL de cada patrón a los pocillos estándar. Añadir 25 μL de cada muestra de suero o plasma diluido a los pocillos de muestra.
- Cuentas mezcladas en vórtice durante 30 s. Agregue 25 μL de cuentas mezcladas a cada pocillo, agitando el frasco de cuentas de forma intermitente para evitar que se asienten. El volumen final debe ser de 75 μL en cada pocillo después de la adición de perlas.
- Selle la placa con un sellador de placas. Envuelva toda la placa, incluida la cubierta de la placa invertida, con papel de aluminio. Coloque la placa en un agitador de placas, asegúrela y agite a aproximadamente 500 rpm durante 2 h a temperatura ambiente. Para evitar fugas, no aplique presión positiva al sellador de placas.
- Sin invertir, coloque la placa en el colector de vacío, aplique vacío como antes y agregue 200 μL de tampón de lavado 1x a cada pocillo.
- Retire el contenido de los pocillos de la placa de ensayo mediante filtración al vacío. Seque el exceso de tampón de lavado de la parte inferior de la placa con una almohadilla absorbente o toallas de papel. Repita este paso una vez más.
nota: Si el ensayo se realiza utilizando una microplaca de fondo en V o tubos micro FACS, omita los pasos 1.12 y 1.13. En su lugar, centrifugue la placa a 1.000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente, y luego retire el sobrenadante con una pipeta multicanal.
- Agregue 25 μL de anticuerpos de detección (consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo.
- Selle la placa con un sellador de placas nuevo. Envuelva toda la placa, incluida la cubierta de la placa invertida, con papel de aluminio.
- Coloque la placa en un agitador de placas y agite a aproximadamente 500 rpm durante 1 h a temperatura ambiente.
- Sin aspirar, añadir 25 μL de reactivo de estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE) directamente a cada pocillo. No es necesario diluir el reactivo.
- Selle la placa con un sellador de placas nuevo. Envuelva toda la placa, incluida la cubierta de la placa invertida, con papel de aluminio.
- Coloque la placa en un agitador de placas y agite a aproximadamente 500 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Repita el paso 1.13 anterior.
- Agregue 200 μL de 1x tampón de lavado a cada pocillo. Vuelva a suspender las cuentas en un agitador de platos durante 1 min.
- Usando una pipeta multicanal, transfiera las muestras de la placa del filtro a los tubos FACS para leer las muestras en un citómetro de flujo.
nota: El volumen de la muestra se puede aumentar de 200 μL a 300 μL agregando 100 μL adicionales de 1x tampón de lavado a cada tubo para evitar que la muestra se seque. Si es necesario, las muestras pueden almacenarse a 4 °C, protegerse de la luz y analizarse al día siguiente. Sin embargo, el almacenamiento prolongado de la muestra puede provocar una reducción de la señal.