Una técnica para detectar cepas de cianobacterias utilizando un chip de micromatriz de anticuerpos

Resumen

Fuente: Blanco, Y. et al., Protocolo experimental para la detección de cianobacterias en muestras líquidas y sólidas con un chip de microarray de anticuerpos.J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra un método para detectar las cepas de cianobacterias en una muestra ambiental utilizando un chip de microarray de anticuerpos. Las muestras portadoras de varias bacterias interactúan con los anticuerpos impresos, y la inmunotinción con anticuerpos anticianobacterianos marcados con fluoróforos revela la presencia de cepas específicas de cianobacterias a través de la fluorescencia en distintos puntos.

Protocolo

1. Preparación de los inmunógenos

1. Cultive cada cepa de cianobacteria en el medio de cultivo correspondiente en las condiciones descritas en la Tabla 1.
   NOTA: El medio de crecimiento y las condiciones de cultivo para cada cepa de cianobacteria se enumeran en la Tabla 1. Todas las cepas de cianobacterias, a excepción de la K17, pertenecen al grupo de Antonio Quesada de la Universidad Autónoma (Madrid, España). El anticuerpo frente a Planktothrix rubescens se generó a partir de una muestra natural de la floración monoespecífica de esta cianobacteria procedente del embalse de Vilasouto (norte de España).
2. Cuantificar el número de células utilizando una cámara de recuento de células mediante microscopía óptica para obtener aproximadamente 10^{a 8} células/mL a partir de un cultivo en fase de crecimiento exponencial tardío o estacionario.
3. Recolectar células de 5 mL de cultivo por centrifugación a 2.000 x g durante 5 min.
4. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un tubo de 10 mL con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato 1x (1x PBS) para obtener alrededor de 10⁸ células/mL.
5. Homogeneizar y lisar las células de la suspensión mediante sonicación durante 5 ciclos, de 30 s cada uno, con una pausa de 30 a 60 s en el hielo, utilizando un procesador ultrasónico portátil de mano o sumergiendo el tubo en el baño de agua de un disruptor celular a máxima amplitud (30 kHz).
6. Repita los pasos 1.3 a 1.5 para cada cepa de cianobacteria.
   NOTA: La sonicación produce disrupción celular y liberación de contenido celular. Si bien las proteínas y los polisacáridos son buenos inmunógenos, las moléculas específicas, como los lípidos y los ácidos nucleicos, no inducen una respuesta inmunogénica humoral por sí mismas. Por lo tanto, deben unirse a portadores, como polisacáridos o proteínas, para aumentar la complejidad molecular. Además, la sonicación libera material intracelular que puede desencadenar la producción de anticuerpos.

>2. Producción de anticuerpos policlonales

1. Prepare la primera dosis de inmunógeno mezclando 0,5 mL del lisado celular ultrasonicado obtenido en el paso 1,5 con 0,5 mL de adyuvante de Freund completo. Entregarlo al operador de un animalario para la producción de anticuerpos policlonales de conejo.
2. Prepare tres dosis más como antes para su uso posterior como refuerzos de memoria en el proceso de producción de anticuerpos mezclando 0,5 mL del mismo homogeneato/lisado obtenido en el paso 1.5 con 0,5 mL de adyuvante de Freund incompleto. Dáselos a la instalación de animales para cumplir con el proceso de producción de anticuerpos.
3. Repita los pasos 2.1 y 2.2 para cada nuevo proceso de producción de anticuerpos.
   NOTA: Normalmente, la producción de anticuerpos se confía a instalaciones o empresas especializadas en animales porque se requieren licencias y capacitación adecuadas para trabajar con animales. Las empresas suministran una medición relativa del ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) de la cantidad de anticuerpos específicos de antígeno presentes en la muestra de suero.

>3. Purificación de anticuerpos

1. Purifique la fracción de inmunoglobulina G (IgG) del suero inmunitario y preinmune recogido en el paso 2 mediante cromatografía de afinidad de proteína A. Algunos kits de purificación comerciales, basados en sistemas de cartuchos, funcionan bien; Siga las instrucciones del proveedor.
2. Cuando el kit de purificación no proporciona un sistema de desalinización, cambie el tampón después de la elución de los anticuerpos purificados a 0,1x PBS, ya sea por diálisis o mediante el uso de dispositivos de filtro centrífugo con un tamaño de poro de membrana de 100 kDa (o inferior).
3. Determine la concentración de anticuerpos midiendo la absorbancia a 280 nm o utilizando métodos colorimétricos, como Bradford, Lowry o ácido bicinconínico (BCA).
   NOTA: Es importante evitar incluir grupos amina en el tampón de elución (por ejemplo, tampones Tris) porque compiten con el anticuerpo por unirse a superficies sólidas activadas con grupos epoxi. Después de la purificación, es importante probar la actividad de los anticuerpos con ELISA.

>4. Marcaje de anticuerpos de fluorescencia

1. Etiquete los anticuerpos purificados obtenidos en la sección 3 con un fluorocromo (por ejemplo, un colorante fluorescente de color rojo lejano) disolviendo un vial comercial que contenga colorante para marcar 1 mg de proteína en 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO). Añadir 2 μL del colorante disuelto a cada preparación de anticuerpos a una concentración de 2 mg/mL en un volumen final de 50 μL en solución salina tamponada con fosfato de 50 mM (pH 8,5).
2. Mantener las reacciones de etiquetado bajo agitación continua durante 1 h a temperatura ambiente y 1.200 rpm en una plataforma vibratoria.
3. Purifique los anticuerpos marcados mediante cromatografía de exclusión por tamaño (p. ej., utilizando un gel con un rango de fraccionamiento entre 1,5 y 30 kDa atrapado en una columna), siguiendo las recomendaciones del proveedor.
4. Mida la absorbancia a 280 nm y a 650 nm en eluidos y calcule las eficiencias del etiquetado siguiendo las recomendaciones del proveedor.
   NOTA: Se pueden realizar hasta 50 reacciones de marcaje de anticuerpos de 50 μL con un solo vial del tinte fluorescente para marcar 1 mg de proteína. Se recomienda cubrir los tubos con papel de aluminio o, alternativamente, utilizar tubos opacos de 0,5 ml para evitar procesos de enfriamiento después del paso 4.3. En el caso de los anticuerpos IgG, el marcaje óptimo se logra con 3-7 moles de colorante por mol de anticuerpo.

>5. Producción de CYANOCHIP

1. Anticuerpos y controles en la solución de impresión
   1. Prepare 30 μL de cada anticuerpo purificado en solución de impresión mezclando cada anticuerpo a 1 mg/mL en un tampón comercial de impresión de proteínas 1x con 0.01% (v/v) Tween 20 (un detergente no iónico), todo como concentraciones finales.
      NOTA: Alternativamente, una solución de anticuerpos puede contener 20% de glicerol, 1% (p/v) de sacarosa (o trehalosa, como conservante) y 0,01% (v/v) de Tween 20 en tampón de carbonato (pH 8,5).
   2. Prepare 30 μL de la solución de impresión como controles: (a) 1x tampón de impresión de proteínas con 0,01% (v/v) Tween 20, (b) suero preinmune purificado con proteína-A a 1 mg/mL en 1x tampón de impresión de proteínas con 0,01% (v/v) Tween 20, y (c) albúmina sérica bovina (BSA) a 1 mg/mL en 1x tampón de impresión de proteínas con 0,01% (v/v) Tween 20.
   3. Prepare 30 μL de un suero preinmune purificado y marcado con fluorescencia a diferentes concentraciones (por ejemplo, de 50 μg/mL a 1 μg/mL) en un tampón de impresión de proteínas 1x con Tween 20, como en el paso 5.1.1. Estas muestras se utilizarán como marcadores de marco fluorescente y para la cuantificación de fluorescencia relativa después del manchado.
   4. Añada 30 μL por pocillo de las soluciones de impresión preparadas en los pasos 5.1.1, 5.1.2 y 5.1.3 a las microplacas de 384 pocillos de la más alta calidad para la fabricación de microarrays, como el polipropileno.
      NOTA: El tampón de impresión de proteínas aumenta la calidad y la estabilidad de los anticuerpos, y Tween 20 homogeneiza la morfología de las manchas y aumenta el acoplamiento de proteínas. Se recomienda mantener la microplaca de 384 pocillos a 4 °C antes de su uso. Almacene a -20 °C durante largos períodos de tiempo. El polipropileno tiene un bajo contenido de ADN, proteínas, extracto celular y unión intrínseca a moléculas pequeñas.
2. Impresión de anticuerpos en un portaobjetos de microscopio
   NOTA: Imprima los anticuerpos en portaobjetos de microscopio activados utilizando diferentes plataformas de matriz, como dispositivos de contacto, de aguja dividida o sin contacto, como impresoras piezoeléctricas o tecnologías de "inyección de tinta". En este trabajo, el CYANOCHIP se ha impreso de forma rutinaria por contacto utilizando un sistema robótico (arrayer) capaz de detectar cantidades de nL de los anticuerpos a escala de μm.
   1. Ajuste las condiciones ambientales de la sala de impresión a 20 °C y 40 - 50% de humedad relativa.
   2. Configure los sustratos de los portaobjetos (por ejemplo, portaobjetos de vidrio de microscopio activados con epoxi de 75 x 25 mm) para realizar varias matrices de anticuerpos idénticas en cada portaobjetos.
   3. Localice cada anticuerpo purificado, incluidos los controles y el marco de referencia, en un patrón de manchas triplicado; en estas condiciones, las manchas tienen entre 180 y 200 μm de diámetro.
   4. Después de la impresión, deje las diapositivas durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente para que se sequen, y luego guárdelas a 4 °C; para trabajar en el campo, las diapositivas pueden transportarse y almacenarse a temperatura ambiente durante varios meses.
      NOTA: El CYANOCHIP se imprime en un formato de microarray puntual triplicado con 3 x 8 microarrays idénticos por diapositiva o 9 arrays idénticos en un formato de microarray de 1 x 9. Cada tamaño de matriz no debe ser mayor que las dimensiones de la cámara de reacción para una junta de 24 pocillos (generalmente 7,5 x 6,5 mm en una cámara de hibridación de 3 x 8).
   5. Antes de utilizar el microarray para analizar muestras ambientales, utilice el inmunoensayo de microarray sándwich fluorescente (FSMI) para determinar la dilución de trabajo para cada anticuerpo en una curva de valoración. Para cada anticuerpo, utilice una concentración estándar del inmunógeno correspondiente (10³ - 10⁴ células/mL) y diluciones seriadas del anticuerpo fluorescente (entre 1:500 y 1:32.000). La concentración óptima de anticuerpos corresponde al 50% de la intensidad máxima de la señal obtenida en la curva de titulación. Además, se debe determinar la sensibilidad y especificidad de cada anticuerpo, tal y como se describe en Blanco et al.

>6. Preparación de extractos multianalitos ambientales para el inmunoensayo de microarrays sándwich fluorescentes (FSMI)

1. Extracto multianalito de una muestra líquida
   1. Tome de 1 a 100 mL de la muestra líquida con una jeringa estéril (por ejemplo, agua de la orilla de un depósito de agua); la cantidad de muestra depende en gran medida de la concentración potencial de los objetivos.
   2. Concentre las células haciendo pasar la muestra de agua a través de un filtro de policarbonato de 47 mm de diámetro y tamaño de poro de 3 μm; una concentración celular entre 10³ - 10⁸ células/mL es deseable para la detección positiva, pero se desconoce la concentración real.
   3. Recupere la biomasa recolectada en el filtro con 1 mL de un tampón reforzado con Tween 20 (TBSTRR; 0,4 M de Tris-HCl (pH 8), 0,3 M de NaCl y 0,1% de Tween 20) raspándola con una espátula en un tubo de 15 mL.
   4. Homogeneizar y desagregar utilizando un procesador ultrasónico portátil, como se describe en el paso 1.5, o simplemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces; esto prepara la muestra para el análisis por parte del microarray.
2. Extracto multianalito de una muestra sólida
   1. Pese hasta 0,5 g de la muestra sólida (por ejemplo, roca, tierra o sedimentos) en un tubo de 10 ml y añada hasta 2 ml de TBSTRR.
   2. Sonicate sumergiendo la sonda del sonicador en el tubo, sumergiendo el tubo en el baño de agua de una potente bocina sonicadora o utilizando un sonicador de mano. Realice al menos 5 ciclos de 30 s a 30 kHz, deteniéndose durante 30 s mientras está en el hielo.
   3. Filtro para eliminar arena, arcilla y otros materiales gruesos con una jeringa de 10 ml acoplada a un portafiltros de nailon de 10 a 12 mm de diámetro y 5 a 20 μm de tamaño de poro. Empuje la muestra a través del filtro en un tubo de 1,5 ml. Si el filtro se satura, agite la suspensión en la jeringa y llévela a una nueva; Esto prepara el material filtrado para el inmunoensayo (paso 7).
      NOTA: La capacidad de almacenamiento intermedio de TBSTRR depende del tipo de muestra. Es importante realizar el inmunoensayo inmediatamente después de la preparación del extracto ambiental para evitar el efecto de la degradación enzimática en los analitos. Alternativamente, agregue inhibidores de la proteasa en el extracto ambiental y congele a -80 °C hasta el siguiente paso.

>7. Inmunoensayo de microarrays sándwich fluorescentes (FSMI)

1. Bloqueo del CYANOCHIP
   NOTA: Inmediatamente antes de su uso, trate los portaobjetos impresos para bloquear todos los grupos epoxi libres en el portaobjetos y para eliminar el exceso de anticuerpos no unidos covalentemente.
   1. Sumerja el microarray en 0,5 M de Tris-HCl (pH 9) con una solución de BSA al 5% (p/v) sobre una superficie limpia (por ejemplo, una placa de Petri o un tubo de 50 mL) con una agitación leve desde una plataforma basculante durante 5 min. Alternativamente, coloque el portaobjetos sobre una gota de 100 a 200 μL de la solución anterior con los puntos del microarray hacia él. Deje actuar de 3 a 5 minutos y luego continúe.
   2. Levante con cuidado el portaobjetos con pinzas con punta de plástico; trate de evitar tocar las zonas de microarrays. Elimine el exceso de líquido golpeando suavemente el portaobjetos sobre una toalla de papel. Sumérjalo en Tris-HCl 0,5 M (pH 8) con una solución BSA al 2% (p/v) durante 30 minutos con una agitación suave desde una plataforma basculante.
   3. Seque el portaobjetos realizando una centrifugación corta (200 - 300 x g durante 1 min) utilizando una microcentrífuga comercial adaptada para portaobjetos de microscopio. Alternativamente, seque el portaobjetos golpeando suavemente sobre una toalla de papel.
2. Incubación del extracto de muestra multianalito con el microarray
   1. Coloque el portaobjetos en un casete de hibridación de microarrays comercial con 24 pocillos para múltiples microarrays; siga las instrucciones del proveedor.
   2. Después del ensamblaje del portaobjetos y el casete, pipetee hasta 50 μL del extracto de la muestra o una dilución del mismo en TBSTRR en cada pocillo del casete.
   3. Repita el paso 7.2.2 para cada muestra que se vaya a analizar.
   4. Como control en blanco, pipetee 50 μL de tampón TBSTRR en al menos dos pocillos separados del casete.
   5. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h con mezcla pipeteando cada 15 min o dejándolo agitar suavemente. Alternativamente, incubar durante 12 h a 4 °C.
      NOTA: Utilice otras juntas de incubación en función del patrón de microarrays. El tiempo y la temperatura de la incubación en el paso 7.2.5 son parámetros empíricos que normalmente dependen de la afinidad y la cinética de unión de cada antígeno-anticuerpo emparejado.
3. lavado
   1. Retire las muestras colocando el casete en el suelo y golpeándolo con cuidado sobre un papel limpio y absorbente.
   2. Lave los pocillos añadiendo 150 μL de TBSTRR a cada uno, y elimine el tampón, como se ha indicado anteriormente.
   3. Repita el paso 7.3.2 tres veces más.
4. Incubación con anticuerpos detectores fluorescentes
   1. Agregue 50 μL de una mezcla de anticuerpos que contenga los 17 anticuerpos contra la cepa de cianobacterias, cada uno marcado con el fluorocromo en TBSTRR con 1% (p/v) de BSA. Determine la concentración de cada anticuerpo fluorescente en la mezcla (de 0,7 a 2 μg/mL) realizando experimentos de titulación de cada par antígeno/anticuerpo.
   2. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente, como se describe en el paso 7.2.5, o durante 12 h a 4 °C.
5. Lavado de los anticuerpos fluorescentes
   1. Retire los anticuerpos fluorescentes no unidos, como en el paso 7.3.
   2. Desmonte el casete y sumerja el portaobjetos en PBS 0,1x (por ejemplo, en un tubo de 50 ml) para un enjuague rápido.
   3. Seque el portaobjetos como en el paso 7.1.3.

>8. Escaneo de fluorescencia

1. Escanee el portaobjetos en busca de fluorescencia en el pico de fluorescencia de máxima emisión para el tinte fluorescente rojo lejano en un escáner para fluorescencia. Tome varias imágenes de los microarrays con diferentes parámetros de escaneo, generalmente disminuyendo el valor de ganancia del láser.
   nota: Evite las manchas saturadas (> 65.000 recuentos de fluorescencia), ya que están fuera de escala y pueden introducir errores de cuantificación.

Tabla 1. Lista de los anticuerpos (abs) y las cepas de cianobacterias utilizadas para producir el CYANOCHIP.

Código Ab	Inmunógeno (cepa)	orden	hábitat	Medio	Condiciones de cultivo
K1	Anabaena sp.	Nostocales	desconocido	BG11 y nitrato	30 ºC, luz continua
K2	Anabaena sp.	Nostocales	desconocido	BG11o	30 ºC, luz continua
K3	Microcystis flosaquae	Chroococcales	Planctónicos	BG11	28 ºC, luz continua
K4	Microcystis novacekii	Chroococcales	Planctónicos	BG11	28 ºC, luz continua
K5	Microcystis aeruginosa	Chroococcales	Planctónicos	BG11	28 ºC, luz continua
K6	Aphanizomenon ovalisporum	Nostocales	Planctónicos	BG11o	28 ºC, luz continua
K7	Phormidium sp.	Oscillatoriales	bentónico	BG11	18 ºC, 16-8 fotoperiodo
K8	Rivularia sp.	Nostocales	bentónico	CHU-D	18 ºC, 16-8 fotoperiodo
K9	Chamaesiphon sp.	Chroococcales	bentónico	BG11	18 ºC, 16-8 fotoperiodo
K10	Leptolyngbya boryana	Oscillatoriales	bentónico	BG11	18 ºC, 16-8 fotoperiodo
K11	Tolypothrix distorta	Nostocales	bentónico	BG11o	18 ºC, 16-8 fotoperiodo
K12	Aphanizomenon aphanizomenoides	Nostocales	Planctónicos	BG11o	28 ºC, luz continua
K13	Nostoc sp. (Antártida)	Nostocales	bentónico	BG11o	13 ºC, fotoperiodo 16-8
K14	Anabaena sp.	Nostocales	bentónico	BG11o	13 ºC, fotoperiodo 16-8
K15	Leptolyngbya sp.	Oscillatoriales	bentónico	BG11	13 ºC, fotoperiodo 16-8
K16	Tolypothrix sp.	Nostocales	bentónico	BG11	13 ºC, fotoperiodo 16-8
K17	Planktothrix rubescens	Oscillatoriales	Planctónicos	ninguno	ninguno

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtros de 0,22 mm de diámetro de poro	Millipore	GSWP04700	Para la preparación de inmunógenos
Microcentrífuga Eppendorf 5424R	Fisher Científico		Para la preparación de inmunógenos
Tampón de fosfato salino (PBS) pH 7,4 (10X)	Thermofisher Científico	70011036	50 mM de fosfato de potasio, 150 mM de NaCl, pH 7,4
Procesador ultrasónico UP50H	Hielscher		Para la preparación de inmunógenos
Completa el adyuvante de Freund	Sigma-Aldrich	F5881	Inmunopotenciador
Coadyuvante incompleto de Freud	Sigma-Aldrich	F5506	Para inyecciones de refuerzo
Kit de purificación de anticuerpos de proteína A	Sigma-Aldrich	PURE1A	Para el aislamiento de IgG
Filtradores centrífugos MWCO<100 KDa	Millipore	UFC510096-96K	Para el aislamiento de IgG
Tubos de diálisis benzoilados	Sigma-Aldrich	D7884-10FT	Para el aislamiento de IgG
Columnas Illustra Microspin G-50	GE-HealthCare	GE27-5330-02	Para el aislamiento de IgG
Reactivo de Bradford	Sigma-Aldrich	B6916-500 mL	Para cuantificar la concentración de anticuerpos
Kit de ensayo de proteínas MicroBCA	Termo Científico	23235	Para cuantificar la concentración de anticuerpos
Tampón de matriz de proteínas 2X	Whatman (Sigma Aldrich)	S00537	Tampón de impresión: 30-40% de glicerol en 1X PBS con 0,01% Tween 20
Preadolescente 20	Sigma-Aldrich	P9416	Detergente no iónico
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418	Control para la impresión; reactivo de bloqueo
Microplaca de 384 pocillos	Genetix	X6004	Para la impresión de anticuerpos
Manipulador de robots para múltiples correderas	Arreglo MicroGrid II TAS de Digilab		Para la impresión de anticuerpos
Portaobjetos de vidrio con sustrato epoxi	Corporación Arrayit	VEPO25C	Soporte sólido para la impresión de anticuerpos
Alexa Fluor-647 Succinimidyl-éster	Sondas moleculares	A20006	fluorocromo
Dmso	Sigma-Aldrich	D8418	Disolvente de fluorocromo
Agitador de plataforma vibratoria Heidolph Titramax	Fisher Científico		Para el marcaje de anticuerpos
Columnas Illustra Microspin G-50	atención sanitaria	27-5330-01	Para la purificación de anticuerpos marcados
Sellado seguro tubos marrones de 0,5 ml	Sarstedt	7,27,04,001	Para el almacenamiento de anticuerpos marcados
Espectrofotómetro Nanodrop 1000	Termo Científico		Para cuantificar la concentración de anticuerpos y la eficiencia del marcaje
Filtro de policarbonato de 47 mm de diámetro de 3 μm de tamaño de poro	Millipore	TMTP04700	Para concentrar las células
Solución de clorhidrato de Trizma 1M pH 8	Sigma-Aldrich	T3038	Para la preparación de TBSTRR; para bloquear correderas
cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S7653	Para la preparación de TBSTRR
Filtros de nailon de 20 μm	Millipore	NY2004700	Para la preparación de extractos medioambientales
Portafiltros de 10-12 mm	Millipore	SX0001300	Para la preparación de extractos medioambientales
Cóctel de inhibidores de la proteasa	Sigma-Aldrich	P8340	Para el almacenamiento de extractos medioambientales
Solución de clorhidrato de Trizma 1M pH 9	Sigma-Aldrich	T2819	Para bloquear diapositivas
Heidolph Duomax 1030 agitador de plataforma mecedora	VWR		Para bloquear portaobjetos; para procesos de incubación
Microcentrífuga miniarray VWR Galaxy	VWR	C1403-VWR	Para secar portaobjetos
Casete de hibridación de microarrays multipocillos	Corporación Arrayit	AHC1X24	Cassette para 24 ensayos por portaobjetos
Escáner de microarrays GenePix 4100A	Dispositivos moleculares		Escáner de fluorescencia
Software GenePix Pro	Dispositivos moleculares		Software para el análisis y la cuantificación de imágenes