Inmunotinción de células encapsuladas en un sistema de hidrogel 3D

Resumen

Fuente: LeSavage, B. L., et al. Producción de hidrogeles de proteínas similares a elastina para la encapsulación e inmunotinción de células en 3D. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo muestra una técnica para inmunotinción de células encapsuladas en un hidrogel 3D. El cultivo de hidrogel que contiene células progenitoras neurales se fija, se permeabiliza y se trata con una solución bloqueante para evitar la inmunotinción inespecífica. Se añade un cóctel de anticuerpos primarios para unirse a proteínas específicas, seguido de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia y una tinción nuclear. A continuación, la muestra se monta en un portaobjetos y se observa bajo un microscopio confocal.

Protocolo

1. Encapsulación celular en hidrogeles 3D de proteínas similares a elastina (ELP)

1. Preparación de moldes de silicona
   1. Utilice un punzón de biopsia con el diámetro deseado para crear agujeros en una lámina de silicona de 0,5 mm de grosor y corte un cuadrado alrededor de cada agujero. Repita el número de moldes deseados.
      NOTA: El diámetro y el grosor de los moldes se pueden ajustar para la aplicación particular y las condiciones de cultivo celular. En la práctica, para cultivos celulares de 50 x 10⁶ células/mL, se recomiendan moldes de 0,5 mm de espesor con diámetros de 4 mm y 5 mm para una extracción suficiente de ADN/ARN y proteínas, respectivamente. Para la inmunotinción, se puede usar un punzón de biopsia de 2 mm para crear tres orificios adyacentes por molde cuadrado, de modo que se puedan teñir tres réplicas por pocillo.
   2. Retire la envoltura de plástico a cada lado del molde individual con pinzas.
      nota: Evite el contacto con la superficie de silicona expuesta, ya que la contaminación puede disminuir la eficiencia futura de la unión por plasma.
   3. Con unas pinzas, coloque el mismo número de moldes de silicona desnudos y cubreobjetos de vidrio (n.º 1, 12 mm de diámetro) en filas alternas sobre la tapa invertida de una placa de 48 pocillos. Una vez completado, cubra la tapa de la placa de 48 pocillos para evitar la contaminación.
   4. El plasma de oxígeno trata toda la tapa de la placa de 48 pocillos (es decir, moldes y portaobjetos de vidrio). Inmediatamente después, use pinzas para invertir el molde de silicona en el cubreobjetos de vidrio adyacente. Presione firmemente sobre el molde para asegurar la unión. Deje que los moldes se incuben a temperatura ambiente durante 1 h.
      nota: La duración del tratamiento con plasma de oxígeno variará en función del instrumento utilizado. Las condiciones típicas de nuestro instrumento son una ventana de presión de gas de funcionamiento entre 0,3-4 mbar, un flujo de gas oxígeno de 20 cm³/min y una exposición de la muestra al plasma de 10-20 s.
   5. Esterilizar los moldes mediante autoclave. Guarde los moldes a temperatura ambiente en un ambiente estéril hasta su uso.
      nota: Los moldes se pueden almacenar en esta etapa indefinidamente.
2. Preparación de una solución madre de proteínas similar a la elastina
   1. Retire el ELP liofilizado del almacenamiento a 4 °C. Caliente la proteína a temperatura ambiente antes de abrir el tubo para asegurarse de que no se acumule condensación en la proteína durante el uso repetido.
   2. Disuelva ELP en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) a 4 °C con agitación constante (es decir, centrifugado) durante la noche.
      nota: La concentración de la solución madre ELP se diluirá aún más con la adición de una solución de reticulante a una relación volumétrica definida por el usuario. Por ejemplo, para una concentración final de ELP del 3 % (p/v), prepare una solución madre de ELP al 3,75 % (p/v) que se diluirá en una proporción volumétrica de 4:1 de solución ELP:solución de reticulación. Ajuste la concentración según sea necesario para la aplicación deseada.
   3. Filtro estéril ELP solución madre que utiliza un filtro de jeringa de 0,22 μm. Guarde ELP en hielo cuando no esté en uso.
3. En el gabinete de bioseguridad, transfiera los moldes estériles con pinzas estériles a una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos.
4. Preparación de solución madre de cloruro de tetrakis(hidroximetil)fosfonio (THPC)
   1. Diluya el THPC en DPBS justo antes de usarlo. Ajuste la concentración de la solución de THPC de acuerdo con la concentración final de ELP y la relación de reticulación deseada.
      nota: Para el protocolo, se obtendrá una concentración final de ELP del 3% (p/v) mezclando la solución madre de ELP con la solución de THPC en una proporción volumétrica de 4:1. Ajuste según sea necesario.
   2. Agregue 2,6 μL de solución de THPC (80% en agua) a 997,4 μL de DPBS.
      nota: Esta concentración de THPC corresponde a una relación estequiométrica de 1:1 de grupos hidroximetilo en THPC y aminas primarias en la proteína ELP cuando se mezclan soluciones en la proporción volumétrica descrita de 4:1 para un hidrogel ELP final del 3% (p/v). La solución de THPC es viscosa y las gotas de solución pueden adherirse al costado de la punta de la pipeta. Para obtener concentraciones precisas, evite dichas gotas cuando se diluyan en DPBS. Purgue el contenedor de material de THPC con gas nitrógeno para evitar la oxidación de la fosfina y la inactivación del reticulante.
   3. Vortex la solución para mezclar y mantener el hielo.
   4. Filtre estérilmente la solución madre de THPC con un filtro de jeringa de 0,22 μm. Diluya aún más la solución madre de THPC con DPBS estéril para lograr relaciones de reticulación estequiométrica más bajas (por ejemplo, 0,5:1 o 0,75:1).
      nota: El THPC es sensible al oxígeno y la solución diluida debe usarse unas horas después de la preparación.
5. Disociar las células por incubación con tripsina-EDTA en una suspensión unicelular, granular las células y contar las células resuspendidas en medio con un hemocitómetro.
   nota: Los protocolos exactos para este paso dependerán en gran medida del tipo de célula deseado y de la aplicación. Para las células progenitoras neurales utilizadas en este protocolo, se realizó una incubación de tripsina-EDTA al 0,025% a temperatura ambiente durante 1,5 min. Las células se peletizaron a 200 x g durante 2 min. Para aumentar la viabilidad de la célula, las células deben suspenderse en condiciones normales de medio. Las densidades celulares típicas utilizadas para la encapsulación de celdas oscilan entre 1 y 50 x 10⁶ celdas/mL de volumen final de hidrogel. Ajuste según sea necesario.
6. Alícuota el número deseado de células en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml.
7. Centrifugar las células a ~200 x g durante 3 min. Con cuidado, aspire el sobrenadante y mantenga la célula en hielo.
   nota: Es fundamental aspirar completamente todo el sobrenadante para mitigar la dilución adicional del reticulante ELP y THPC. Las velocidades de centrifugación específicas variarán según el tipo de célula.
8. Vuelva a suspender el pellet de celda en la solución madre de ELP de modo que el volumen sea el 80% del volumen final (suponiendo una proporción de 4:1 de solución ELP:solución THPC). Mezcle con pipeta 20-25 veces para producir una mezcla homogénea de las células y ELP.
   nota: Evite agarrar la parte inferior del tubo para mitigar el aumento de temperatura y la posterior transición de fase de ELP. Cada molde de 2 mm con tres réplicas requiere 7,5 μL de volumen final (es decir, 6 μL de solución madre de ELP y 1,5 μL de solución madre de THPC) divididos en partes iguales en los 3 orificios (es decir, 2,5 μL de volumen final por orificio). Para los moldes de 4 y 5 mm, se requiere un volumen final de 7,5 μL y 15,5 μL, respectivamente.
9. Agregue la solución madre de THPC a la suspensión de celda/ELP para obtener el 20% restante del volumen final. Pipetear la mezcla 20-25 veces para producir una mezcla homogénea.
10. Pipetee inmediatamente los volúmenes finales correspondientes de la mezcla de celda / ELP / THPC en cada molde con un movimiento circular. Repita para todos los moldes.
11. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 15 min, seguido de una incubación adicional a 37 °C durante 15 min.
    nota: El primer período de incubación ayudará a facilitar la reticulación inicial del hidrogel antes de aumentar la temperatura por encima de la temperatura de solución crítica más baja (LCST) del ELP e inducir su segregación de fase térmica.
12. Agregue lentamente 750 μL de medio de cultivo celular tibio a cada pocillo de la placa de 24 pocillos, evitando interrumpir los geles.
13. Incubar los hidrogeles a 37 °C durante 7 días.
    nota: Se recomiendan cambios completos del medio cada 1-2 días, dependiendo del tipo de célula. Para limitar la tensión en el gel, utilice una pipeta Pasteur de vidrio adherida con una punta de pipeta de 200 μL cuando aspire el medio desde el pocillo.

2. Inmunocitoquímica de células en hidrogeles ELP 3D

1. Prepare la solución de fijación mezclando 10 mL de paraformaldehído (PFA) al 16% (p/v) en 30 mL de DPBS. Calentar la solución a 37 °C.
2. Aspire el medio de la placa de 24 pocillos y lávese suavemente con 1 ml de DPBS.
3. Añadir 750 μL de la solución de fijación a cada pocillo e incubar a 37 °C durante 30 min. No utilice la incubadora de cultivo de tejidos para evitar la contaminación de otros cultivos con vapor de PFA.
4. Aspire cuidadosamente la solución de fijación de cada pocillo, desechando el PFA en un contenedor de residuos peligrosos apropiado.
   cautela: La exposición al PFA puede causar irritación de la piel y los ojos. Use guantes/gafas de seguridad y trabaje con una campana de gases químicos.
5. Agregue 1 mL de DPBS a cada muestra. Aspire inmediatamente el DPBS y deséchelo en el contenedor de residuos de PFA.
6. Lave las muestras dos veces con 1 mL de DPBS durante 10 min cada una.
   nota: Las muestras se pueden almacenar en DPBS a 4 °C hasta una semana después de sellar la placa con Parafilm.
7. Permeabilizar cada muestra con 750 μL de solución de permeabilización (100 mL de DPBS y 0,25 mL de Triton X-100; PBST) durante 1 h a temperatura ambiente en un balancín a 15 rpm.
8. Aspire el PBST y agregue 750 μL de solución bloqueante (95 mL de PBS, 5 g de albúmina sérica bovina (BSA), 5 mL de suero y 0,5 mL de Triton X-100) a cada muestra. Incubar a temperatura ambiente durante 3 h en un balancín a 15 rpm.
   nota: La solución bloqueante debe contener suero de la especie huésped en la que se han criado los anticuerpos secundarios (p. ej., cabra, burro) y filtrarse estérilmente a través de un filtro de 0,22 μm antes de su uso.
9. Prepare la solución de dilución de anticuerpos (97 mL de DPBS, 2,5 g de BSA, 2,5 mL de suero (de la misma especie huésped a partir de la cual se prepara EPL) y 0,5 mL de Triton X-100). Diluir el anticuerpo primario con la solución de dilución de anticuerpos y añadir 500 μL de la solución a cada muestra. Selle la placa con Parafilm e incube durante la noche a 4 °C en un balancín.
   nota: Los anticuerpos primarios Nestin y Sox2 se diluyeron 1:400 en una solución de dilución de anticuerpos a partir de la concentración original de los fabricantes.
10. Aspire la solución de anticuerpos de cada muestra y lave las muestras con PBST durante 60 minutos a temperatura ambiente en un balancín a 15 rpm. Repita el paso de lavado 3 veces.
11. Diluir los anticuerpos secundarios y 5 mg/mL de DAPI (1:2.000) utilizando la solución de dilución de anticuerpos y añadir 500 μL de la solución a cada muestra. Cubra la placa de 24 pocillos con papel de aluminio e incube durante la noche a 4 °C en un balancín.
    nota: Dado que los anticuerpos secundarios son sensibles a la luz, las muestras deben protegerse del fotoblanqueo en todos los pasos posteriores. Los anticuerpos secundarios anti-ratón y anti-conejo de cabra se diluyeron 1:500 en solución de dilución de anticuerpos a partir de la concentración original de los fabricantes.
12. Aspire la solución de anticuerpos de cada muestra y lave las muestras con PBST durante 30 minutos a temperatura ambiente en el balancín. Repita el paso de lavado 3 veces.
13. Coloque una gota de medio de montaje rígido sobre la superficie de un portaobjetos de vidrio. Con pinzas, retire el exceso de solución del molde secando ligeramente el borde del molde con una toalla de papel. Coloque con cuidado el molde boca abajo sobre el medio de montaje y evite introducir burbujas.
14. Deje que el medio de montaje se endurezca durante 48 h a temperatura ambiente. Almacene las muestras a temperatura ambiente o a 4 °C. Deje que el medio de montaje se asiente por completo durante 48 h antes de obtener imágenes, ya que el índice de refracción del medio cambiará durante el endurecimiento. Selle las muestras al portaobjetos de la cubierta de vidrio con esmalte de uñas transparente para mitigar la contaminación o el movimiento de la muestra.
15. Tome imágenes de las muestras con un microscopio confocal.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Encapsulación de células en hidrogeles ELP 3D
0.22 μm filtros de jeringa	Millipore	SLGV004SL
Lámina de silicona de 0,5 mm de grosor	Ciencia de la Microscopía Electrónica	70338-05
Placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos	Corning	353047
Punzón de biopsia desechable (2 mm)	Integra Miltex	33-31
Punzón de biopsia desechable (4 mm)	Integra Miltex	33-34
Punzón de biopsia desechable (5 mm)	Integra Miltex	33-35
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)	Corning	21-031-CM
Nº 1 cubreobjetos de vidrio de 12 mm	Thermo Fisher Scientific	12-545-80
Cloruro de tetrakis(hidroximetil)fosfonio (THPC)	Sigma-Aldrich	404861-100ML
0.5% Tryspin/EDTA	Thermo Fisher	15400054
Inmunocitoquímica de células en hidrogeles ELP 3D
16% (w/v) Paraformaldehído (PFA)	Ciencias de la Microscopía Electrónica	15701
Albúmina sérica bovina (BSA)	Roche	3116956001
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)	Sondas moleculares	D1306
Suero de burro	Laboratorios Biológicos Lampire	7332100
Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra (AF488)	Sondas moleculares	A-11017
Anticuerpo secundario anti-conejo de cabra (AF546)	Sondas moleculares	A-11071
Suero de cabra	Gibco	16210-072
Anticuerpo primario de nestina de ratón	BD Pharmingen	556309
Anticuerpo primario Sox2 de ratón	Tecnología de señalización celular	23064S
Esmalte de uñas	Ciencias de la Microscopía Electrónica	72180
Tritón X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Vectashield Hardset Medio de montaje	Laboratorios vectoriales	H-1400