Evaluación de la distribución intracelular de conjugados de anticuerpos modificados con péptidos derivados de virus

Resumen

Fuente: Beaudoin, S. et al., Evaluación inicial de anticuerpos-conjugados modificados con péptidos derivados virales para aumentar la acumulación celular y mejorar la diana tumoral.J. Vis. Exp.(2018)

Este video muestra el proceso de evaluación de la distribución intracelular de conjugados de anticuerpos modificados con péptidos derivados de virus utilizando microscopía confocal. La secuencia de localización nuclear derivada del virus dirige los conjugados de anticuerpos dentro del citoplasma, lo que se confirma mediante inmunotinción y medición de fluorescencia.

Protocolo

1. Conjugación de péptidos de anticuerpos

NOTA: El ácido cólico ligado al NLS (ChAcNLS) se puede sintetizar en cualquier fabricante comercial de péptidos o en la plataforma de servicios de síntesis de péptidos afiliada a una universidad.

1. En un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL, prepare una solución de 10 mg/mL (~1 mg de anticuerpo total) de 7G3 en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,6.
2. Disuelva el sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración de 5-10 mM. El vórtice de la solución a fondo funcion....

Resultados

Figura 1: Esquema del enfoque de tratamiento de células AC y posterior procesamiento para el análisis por microscopía confocal y para el análisis de la calidad del fraccionamiento celular. Las flechas rojas corresponden a los pasos esenciales 2.2 y 2.3.

....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sulfo-SMCC	Termo Científico	22122	Hay muchos reticulantes de maleimida homo y heterobifuncionales para elegir.
Filtros centrífugos Amicon Ultra-0,5 mL	EMD Millipore	UFC505096	Hay tamaños de paquete de 8, 24 y 96. Elige según tus necesidades.
Estándares de caleidoscopio de proteínas Precision Plus	BioRad	1610375EDU	Proteínas recombinantes mulicolor de 10-250 kDa.
Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenol	Termo Científico	25200056	Volúmenes de 100 o 500 mL a elegir.
Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón de cabra, conjugado Alexa Fluor 647	Termo Científico	A-21235	Se recomienda 1-10 μg/mL
Búfer de muestras NuPAGE LDS (4x)	Termo Científico	NP0007
2-Mercaptoetanol	Sigma Aldrich	M3148-25ML
Células TF-1a	ATCC	ATCC CRL-2003
RPMI 1640 medio	ATCC	ATCC 30-2001
Microscopio confocal FluoView FV1000	Olimpo
Software Fluoview	Olimpo		www.olympus-lifescience.com