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1. Conjugación de péptidos de anticuerpos
NOTA: El ácido cólico ligado al NLS (ChAcNLS) se puede sintetizar en cualquier fabricante comercial de péptidos o en la plataforma de servicios de síntesis de péptidos afiliada a una universidad.
- En un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL, prepare una solución de 10 mg/mL (~1 mg de anticuerpo total) de 7G3 en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,6.
- Disuelva el sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración de 5-10 mM. El vórtice de la solución a fondo funciona mejor para lograr la disolución completa.
- Agregue al tubo que contiene 7G3 la solución disuelta de azufre-SMCC (generalmente entre 5-20 μL dependiendo de la proporción molar de sulfo-SMCC-a-7G3 deseada). Se recomienda probar las proporciones de sulfo-SMCC a 7G3 de 10, 25 y 50 a 1. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
- Purifique y concentre el 7G3 derivado de maleimida mediante el uso de un dispositivo de ultrafiltración e intercambio de tampones en PBS, pH 7.0. Centrifugar a 8.000 x g durante aproximadamente 5 min. Deseche el flujo y llénelo con PBS, pH 7.0 y vuelva a centrifugar.
- Realice esto 7-8 veces para cambiar el búfer por completo. Recupere la proteína 7G3 concentrada colocando el dispositivo de filtro boca abajo en un tubo de microcentrífuga limpio. Centrífuga durante 2 min a 1.000 x g. El volumen de recuperación debe ser de aproximadamente 0,3 ml.
- En el tubo que contiene el 7G3 activado por maleimida, agregue un exceso molar de 2 veces de ChAcNLS en relación con la relación sulfo-SMCC-7G3 utilizada en el paso anterior e incube durante la noche a 4 °C. Por ejemplo, si se utilizó una proporción de sulfo-SMCC a 7G3 de 10 a 1, utilice una relación de ChAcNLS a 7G3 de 20 a 1. El volumen total no debe modificarse significativamente.
nota: Aunque el ChAcNLS no causa precipitación durante el proceso de conjugación, esta es una posibilidad que podría ocurrir con otros péptidos. Observe el tubo durante la reacción en busca de signos de precipitación, que probablemente se produce cuando los péptidos son hidrofóbicos. En estos casos, puede valer la pena revisar el péptido de interés para diseñar cambios que proporcionen una mayor hidrofilicidad.
- Concentre el 7G3-ChAcNLS utilizando un dispositivo de ultrafiltración hasta la concentración deseada y el intercambio de tampón en PBS pH 7.4 (ver paso 1.4). El rendimiento de recuperación de la proteína total debe ser ≥ el 75% del material de partida original.
- Realizar electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) para evaluar los candidatos a 7G3-ChAcNLS construidos utilizando un gel de poliacrilamida al 12% (proporciona una separación suficiente de las cadenas pesadas y ligeras conjugadas ChAcNLS de las cadenas no conjugadas). Mezcle 10 μg de 7G3-ChAcNLS en un tampón de carga PAGE que contenga 2 μL de β-mercaptoetanol y cárguelo en el pocillo.
- Ajuste el voltaje adecuado (120 V durante 1 h para un gel al 12%) y ejecute la electroforesis. Detenga la electroforesis cuando el frente del tinte Coomassie llegue al fondo del gel.
nota: No dejes que el frente del tinte Coomassie se escurra del gel.
- Retire el gel del aparato de electroforesis y enjuague con una solución decolorante que contenga 10% v/v de ácido acético glacial y 20% v/v de metanol.
- Tome una foto del gel y con una regla y mida la distancia (cm) migrada para los patrones y conjugados 7G3. Calcule el valor del factor de retención (Rf), que es la distancia migrada dividida por la longitud del gel (desde donde se carga la proteína hasta el frente de migración de Coomassie). Trace el peso molecular (MW) en log frente a los valores de Rf de cada patrón de proteína y extrapola el tamaño de los conjugados 7G3.
- Calcule el número de péptidos por anticuerpo dividiendo la diferencia en MW entre los conjugados 7G3 y 7G3 no modificado por 1768,5 g/mol (MW de ChAcNLS).
- Tome imágenes digitales del gel teñido con Coomassie y realice un análisis de densitometría. En este punto, la selección de un candidato principal puede basarse en la CA con el número máximo de moléculas de ChAcNLS que no contiene especies agregadas significativas.
>2. Microscopía Confocal para la Evaluación de la Acumulación Intracelular
NOTA: Es importante probar la selectividad celular de la acumulación intracelular de los mAbs modificados con péptidos antes de desarrollar formulaciones con una carga útil de interés. Debido a que también se ha demostrado que Tat tiene una propensión a la penetración celular inespecífica, vale la pena analizar primero la acumulación intracelular y la selectividad celular antes de emprender costosos pasos de desarrollo con cargas útiles costosas. Por esta razón, el Procedimiento 1 también debe modificar los mAbs de control irrelevantes específicos del isotipo. Para el resto del protocolo, trabajaremos con ACs modificados con 10 moléculas de ChAcNLS por anticuerpo. En la Figura 1 se describe un esquema que incluye los pasos clave para los Procedimientos 2 y 3.
>PRECAUCIÓN: Este paso del protocolo implica el manejo y la manipulación de paraformaldehído. Siga las instrucciones del fabricante cuando lo manipule.
- Trate las células TF-1a diana con 200 nM de 7G3-ChAcNLS, incluidos los mAbs de control modificados. Incubar 5 x 106 células antigénicas positivas con los conjugados durante 1 h a 37 °C.
- Después de 1 h, retire el sobrenadante y lave con 1 mL 3x en PBS helado. Agregue medios nuevos e incube durante una hora adicional a 37 °C.
- Después de la hora adicional, retire el sobrenadante y lave 3 veces en 1 mL de PBS helado. Añadir 0,5 mL de PBS que contenga 0,25% de tripsina y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a 37 °C durante 3 hasta 30 min.
nota: Durante las pruebas piloto iniciales, se recomienda no tripsinizar las células para determinar las diferencias en la acumulación intracelular de CA. Este protocolo promueve el uso de tripsina, y demostramos cómo esto mejora la evaluación de la eficiencia de la acumulación intracelular de diferentes candidatos a AC.
- Pruebe los diferentes tiempos de incubación comprobando visualmente si todas las células se están desprendiendo. Además, incube las alícuotas de las células con soluciones de tinción de viabilidad y realice un análisis de citometría de flujo como se ha descrito anteriormente.
- Neutralizar la tripsina con 1,5 mL de medio de cultivo celular RPMI 1640/10% de suero fetal bovino. Centrifugar las celdas a 500 x g durante 5 min, eliminar el sobrenadante y lavar 3 veces en 0,5 mL de PBS helado.
- Fije las células en 0,5 mL de PBS que contengan un 1% de paraformaldehído y un 1% de sacarosa en hielo durante 30 min. Lave las células 3 veces en 0,5 mL de PBS helado y centrifuga a 250 x g durante 5 min. Permeabilice las células en 0,5 mL de PBS que contengan 0,15% de Triton X-100 durante 5 min en hielo. Lave las células en PBS helado y repita la centrifugación.
- Suspender las células en 0,1 mL de PBS que contengan 2 μg/mL (o la concentración recomendada por el fabricante) de un anticuerpo policlonal secundario Fc antimurino (isotipo específico) conjugado con AlexaFluor 647 durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Centrifugar a 250 x g durante 5 min y lavar las celdas 3x en 0,5 mL de PBS helado. Células de suspensión en 0,5 mL PBS.
pausa: Las células se pueden almacenar en el refrigerador.
nota: Es fundamental seleccionar un anticuerpo secundario que reconozca el isotipo correcto del mAb de interés. Se selecciona AF647 debido a su emisión en el infrarrojo lejano, que no interfiere con la tinción de yoduro de propidio (PI) del núcleo.
- Añadir PI a una concentración de 10 μg/mL al recipiente con células. A continuación, monte 1 x 105 celdas en portaobjetos de vidrio utilizando medios de montaje y cúbralos con un cubreobjetos de vidrio.
- Examine las células con un objetivo de inmersión en aceite Plan Apo 60X NA 1.42 en un microscopio confocal de barrido láser invertido. Detecte la fluorescencia PI utilizando el láser de argón de 488 nm y el prisma de barrido espectral configurado para 600 - 650 nm. Para la fluorescencia AF647, utilice el láser de helio-neón de 633 nm y el prisma de barrido espectral configurado para 650 - 700 nm. Recopile las emisiones de fluorescencia de PI y AF647 secuencialmente.
nota: Utilice la misma configuración durante toda la evaluación y comparación de las celdas. Sin embargo, tendrá que ajustar la configuración de las células tripsinizadas en comparación con las células no tripsinizadas.
- Utilice software de microscopio para adquirir imágenes. Recopile imágenes utilizando secciones ópticas horizontales en serie de 1.024 x 1.024 píxeles con un promedio de línea 2X tomadas a intervalos de 0,5 μm a través de todo el grosor de la celda. Presente las imágenes como proyecciones z apiladas de cuatro cortes consecutivos a la máxima intensidad de fluorescencia.
- Analice las células con software de microscopio. Registre el patrón de distribución celular de los conjugados. En concreto, evaluar si la fluorescencia intracelular en el citoplasma está agrupada y cerca de la superficie celular o es difusa y homogénea. Evalúe también la intensidad relativa de fluorescencia por célula.
