Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación del catéter antes de la cirugía estereotáxica
- Corte los catéteres PE50 (de 6 cm de longitud) que se utilizarán para conectar la cánula con las bombas osmóticas (véase la figura 1). Llene los catéteres PE50 con líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) y selle ambos extremos de los catéteres. Mantenga el catéter a 4 °C hasta que se use.
>2. Implantación de cánula por estereotaxia
- Realizar la cirugía en condiciones estériles. Esterilizar todos los instrumentos y materiales quirúrgicos mediante autoclave. Limpie a fondo el aparato estereotáxico y el área de trabajo y desinfecte con una solución de etanol al 70%. Use una mascarilla quirúrgica, un gorro para el cabello y guantes estériles.
- Anestesiar ratas inyectando por vía intraperitoneal (i.p.) una solución de ketamina y xilacina (100 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente). Confirme la anestesia controlando el movimiento después de un suave pellizco en el dedo del pie.
- Inyectar un antiinflamatorio no esteroideo (Meloxicam; 1 mg/kg) por vía subcutánea (s.c.) al animal anestesiado al menos 30 min antes de la cirugía.
- Afeitar la cabeza del animal con una maquinilla y desinfectar la piel tres veces con una solución de gluconato de clorhexidina al 2% y alcohol isopropílico al 2%. Aplique ungüento oftálmico veterinario en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
- Coloque al animal en un marco estereotáxico con las barras de las orejas. Fije una cánula en el brazo de soporte del marco estereotáxico. Inyecte (s.c.) un agente anestésico local (bupivacaína (1,5 mg/kg) y lidocaína (1,5 mg/kg) en la parte superior de la cabeza. La anestesia se mantiene durante todo el procedimiento mediante la colocación de un cono nasal que suministra isoflurano al 3%. Todo el campo quirúrgico debería cubrirse, pero no se hizo aquí para demostrar mejor la técnica.
- Haz una incisión de 3 cm en la parte superior de la cabeza con un bisturí. Instale 4 pinzas alrededor de la incisión para dejar el cráneo despejado. Con una tijera de punta redonda, haga un bolsillo (2 x 2 cm2) debajo de la piel entre los omóplatos del animal.
- Raspe el periostio del cráneo con una cuchilla. Aplique una gasa en el cráneo si está sangrando.
- Verifica que el cráneo esté plano y bien alineado en el marco estereotáxico. Para asegurarse de que el cráneo sea plano, verifique las coordenadas de altura en el bregma y lambda. Tome las coordenadas bregma que se utilizarán como punto de referencia.
- A partir del bregma, calcular las coordenadas de las dos cánulas guía que se implantarán bilateralmente en el hipocampo (anteroposterior: - 0,42 cm; mediolateral: ± 0,30 cm; dorsoventral: - 0,28 cm según el atlas cerebral de rata de Paxinos y Watson). Indicar la posición de la cánula con un rotulador.
- Taladre un orificio (0,5 mm) en el cráneo en el punto de implantación de ambas cánulas. Taladre otros dos orificios aproximadamente 5 mm por encima y por debajo de esos puntos para insertar tornillos que solidificarán la cánula al aplicar cemento dental.
- Corte un extremo del catéter previamente lleno de líquido cefalorraquídeo con un bisturí e insértelo en el brazo angular de la cánula. Fijar la primera cánula con cemento dental. Evite colocar cemento dental alrededor de la posición de la segunda cánula.
- Deje que el cemento dental se seque durante 2 a 3 minutos, luego retire el brazo soporte de la primera cánula y fije la segunda cánula en él. Repita los pasos 2.11 y 2.12. Coloque una cánula ficticia en ambas cánulas guía. Asegúrese de que el chupete y la cánula guía tengan la misma longitud para evitar la infiltración de tejido y el bloqueo de la cánula.
- Insertar el extremo libre de ambos catéteres en el bolsillo previamente hecho entre los omóplatos del animal. Retire las pinzas y cose la piel con un hilo de sutura 4-0.
nota: La cánula guía superior debe ser accesible para las próximas infusiones de Aβo.
- Retira al animal del marco estereotáxico y vuelve a colocarlo en su jaula. Durante la recuperación postquirúrgica, coloque la jaula sobre una manta de agua caliente hasta que el animal se despierte. La jaula debe estar parcialmente en la almohadilla para que la rata pueda escapar del calor si es necesario. Vigile al animal constantemente hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
- Regrese las ratas al animalario para que se recuperen de la cirugía durante 10 días bajo estrecha supervisión.
nota: No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado. Meloxicam (1 mg/kg) se administra una vez al día durante dos días después de la cirugía para tratar el dolor.
>3. Instalación de la bomba osmótica
- Un día antes de la instalación, llene las bombas osmóticas con el anticuerpo 6E10 (1 mg/ml; 100 μl) y controle el anticuerpo IgG1 (1 mg/ml; 100 μl) de acuerdo con las instrucciones del fabricante en condiciones estériles. Mantenga las bombas en agua destilada estéril a 37 °C durante la noche para activar las bombas.
- Anestesiar ratas con isoflurano al 3% para instalar bombas osmóticas (0,5 μl/h durante 7 días). Afeitar entre los omóplatos y desinfectar la piel con una solución de gluconato de clorhexidina al 2% y alcohol isopropílico al 2%. Realizar una incisión de 2 cm con un bisturí entre los omóplatos para localizar los catéteres PE50 conectados a la cánula guía.
- Cortar el extremo de los catéteres PE50 que contienen cemento dental con un bisturí. Conecte las bombas osmóticas a los catéteres PE50 y agregue un poco de cemento dental en la unión de la bomba y el catéter para asegurar la conexión.
- Cose la piel firmemente con un hilo de sutura 4-0. Vuelva a colocar al animal en su jaula sobre una almohadilla de agua caliente. Observe cómo el animal se despierta rápidamente de una anestesia con isoflurano (unos 5 min).
nota: La cirugía dura aproximadamente de 5 a 10 min.
>4. Infusiones de Aβo en ratas despiertas y que se mueven libremente
- Preparar la solución de Aβo (0,2 μg/μl). Deje que Aβo se agregue dinámica y espontáneamente durante 1 hora a temperatura ambiente antes de la infusión.
- Instale dos jeringas de 10 μl en una bomba de infusión. Llene las jeringas con 5 μl de agua destilada estéril. Corte dos catéteres PE50 de unos 60 cm de longitud con un bisturí. Llene ambos catéteres con agua destilada estéril utilizando jeringas de 1 ml y agujas de 21 G.
- Mantenga las jeringas de 1 ml en un extremo del catéter y conecte el otro extremo a las jeringas Hamilton. Retire las jeringas de 1 ml y compruebe que no haya burbujas de aire dentro de los catéteres.
- Inserte la cánula interna en el extremo de los catéteres PE50. Con agua destilada estéril, llene la cánula interna conectada a los catéteres PE50 hasta 1 μl en jeringas Hamilton. Haga una burbuja de aire tirando de los pistones hacia atrás hasta 2 μl.
- Mezcle la solución de Aβo pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una punta de mínima adherencia. Evite formar burbujas durante la mezcla. Llene ambas cánulas internas con 1,5 μl de solución de Aβo tirando de los pistones hacia atrás hasta 3,5 μl.
- Haga líneas con un marcador antes y después de la burbuja de aire en ambos catéteres. Esto sirve como un punto de control para la infusión en curso. Para la infusión, acerque la jaula a la bomba de infusión y retire la tapa.
- Coloque a la rata en un acurrucarse y raspe firmemente el brazo del acurrucado alrededor de su cuello para inmovilizar la cabeza de la rata. Retire la cánula ficticia de las dos cánulas guía. Inserte la cánula interna previamente preparada en la cánula guía. Verifique que estén completamente insertados y bien fijados a la base de la cánula guía.
- Suelta a la rata del acurrucamiento y vuelve a colocarla en su jaula para limitar el estrés de contención. Vigile de cerca para asegurarse de que los catéteres no se retuerzan y que la infusión se realice correctamente.
- Encienda la bomba de infusión. Inyecte 1 μl de solución de Aβo a una velocidad de 0,1 μl/min (10 min). Durante la perfusión, compruebe que el pistón de la jeringa se mueve de 3,5 μl a 2,5 μl y que la burbuja de aire de ambos catéteres PE50 se mueve continuamente.
- Deje la cánula interna en su lugar durante otros 5 minutos después de la infusión para permitir una difusión eficiente de la solución de Aβo. Vuelva a colocar la rata en el acurrucamiento para retirar la cánula interna y la cánula guía tapada para evitar el reflujo de la solución inyectada. Use una cánula ficticia que se detenga justo antes del brazo angular de la cánula. Regrese al animal a su jaula.
- Repita la infusión de Aβo una vez al día durante 6 días consecutivos. Eutanasia del animal por decapitación.
