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>1. Fabricación y funcionalización de inmunosondas capacitivas
- Corte una longitud de 25 cm de alambre de platino recubierto de perfluoroalcoxi (PFA) (consulte la Tabla de materiales) y pele aproximadamente 5 mm de recubrimiento de PFA de un extremo con un bisturí, teniendo cuidado de no cortar el alambre de platino.
- Inserte el extremo pelado del cable de platino en una clavija de conector macho chapada en oro de 1 mm y engarce los dientes de la clavija del conector alrededor del extremo pelado del alambre de platino con unos alicates de punta fina (consulte la Tabla de materiales).
- Suelde el cable de platino a la clavija del conector chapada en oro. Tenga cuidado de no usar una cantidad excesiva de soldadura.
- Prepare la solución de dopamina disolviendo 50 mg de HCl de dopamina en 50 mL de solución salina tamponada con fosfato de 10 mM (PBS, pH 6,0) agitando.
- Una vez que la dopamina se haya disuelto por completo, coloque la punta del alambre de platino en el recipiente que contiene el PBS recién hecho suplementado con dopamina. Conecte una clavija de conector dorada en un canal de la cabecera (consulte la tabla de materiales).
- Conecte el electrodo de disco de cloruro de plata (AgCl) (electrodo de tierra, consulte la tabla de materiales) al canal de tierra en la etapa principal. Coloque el disco de AgCl en el recipiente que contiene PBS suplementado con dopamina e hilo de platino; Tenga cuidado de sumergir solo el electrodo de disco y no cualquier longitud del cable o la soldadura. Conecte una derivación de cable en los canales de referencia de la etapa principal antes de continuar.
- Abra el software interactivo de adquisición de datos (consulte la tabla de materiales). Prepare un protocolo de potencial de comando de electrodeposición de diente de sierra con los siguientes parámetros: potencial de inicio = −0,6 V; potencial final = +0,65 V; velocidad de escaneo = 0,04 V∙s-1; Duración de la deposición = 420 s. Comience el protocolo de deposición de polidopamina, asegurándose de que todos los cables estén conectados correctamente.
- Después de completar la deposición de polidopamina, retire la pelleta molida de AgCl y la punta del alambre de platino del recipiente, teniendo cuidado de no tocar la punta del electrodo de alambre de platino. Coloque la punta del alambre en un microtubo que contenga PBS (pH 7,4) durante 2-5 minutos mientras se prepara la solución de anticuerpos; Asegúrese de que la punta del alambre no entre en contacto con los lados o la parte inferior del microtubo.
NOTA: La solución de anticuerpos se puede producir durante la deposición de polidopamina; sin embargo, no se debe omitir la transferencia del alambre de platino desde el recipiente que contiene dopamina al microtubo de PBS después de la deposición de polidopamina.
- Prepara la solución de anticuerpos. Combine el anticuerpo de interés con PBS (pH 7.4) en una proporción de 1:20 en un recipiente de un tamaño apropiado (por ejemplo, un microtubo).
NOTA: El anticuerpo monoclonal anti-neuropéptido Y (anti-NPY) (ver Tabla de Materiales) utilizado aquí se alícuota a 1 mg/mL; un ejemplo de preparación de anticuerpos aquí sería 4 μL de anticuerpo por 76 μL de PBS.
- Remoje la punta depositada en polidopamina del electrodo de platino en una solución de anticuerpos durante un mínimo de 2 h a temperatura ambiente, asegurándose nuevamente de que la punta del alambre de platino esté suspendida en solución y no descanse en la superficie interior del microtubo. < />
NOTA: La implementación reciente de esta técnica ha favorecido el uso del electrodo de alambre de platino inmediatamente después de este paso en lugar del almacenamiento húmedo o seco para su uso posterior.
- Después de sumergir la solución de anticuerpos, enjuague brevemente la punta de la inmunosonda capacitiva (sonda CI) recién funcionalizada en PBS (pH 7,4). La sonda ya está lista para su uso.
>2. Configuración experimental para la detección y medición in vitro de péptidos
- Coloque la punta funcional de la sonda CI en la cámara de flujo, teniendo cuidado de no alterar la punta del electrodo de ninguna manera, ya que al hacerlo puede dañar la punta sensorial de la sonda.
NOTA: La cámara de flujo se creó vertiendo elastómero de silicona (ver Tabla de Materiales) en una placa de cultivo de 35 mm con un relleno de espacio ovoide alargado en el centro de la placa. Después del endurecimiento, la forma ovoide se elimina del elastómero. A continuación, la cámara se superfunde con solución salina tamponada con Tris (TBS) y se permite un caudal de 3 mL/min. Asegúrese de que el flujo de entrada y salida mantenga el nivel de fluido en la cámara de tal manera que no se observe la acción de marea del superfusado. El flujo debe permanecer en su lugar durante todo el tiempo que la sonda CI esté en uso.
- Antes de la primera prueba experimental, realice una ejecución estándar de TBS para acondicionar la sonda de CI. Configure el siguiente protocolo de voltaje de comando: potencial de paso positivo = +100 mV; potencial de paso negativo = −5 mV; duración del paso = 20 ms; Duración de la adquisición = 600 s.
NOTA: Es importante tener en cuenta el equilibrio de la sonda durante la fase inicial del potencial de comando cíclico antes de la adquisición de datos.
- Cree una solución del péptido de interés utilizando el mismo TBS para mantener la composición del superfusato. Configure un sistema de colector en el que el superfusato pueda conmutarse entre TBS y TBS suplementado con péptidos sin introducir burbujas en el sistema de tubos o en la cámara de flujo.
NOTA: En el presente estudio se utilizó péptido sintético NPY porcino (ver Tabla de Materiales).
- Configure el protocolo de adquisición de datos de detección de péptidos utilizando los parámetros estándar de TBS (consulte el paso 2.2.).
NOTA: En esta implementación, la duración de cada prueba experimental fue de 360 s (120 s TBS, 120 s TBS suplementado con péptidos, 120 s TBS).