1. Preparación antes del etiquetado
- Preparación y mantenimiento de cultivos primarios de hipocampos
- Preparar cultivos primarios de hipocampo a una densidad de 150.000 células en cubreobjetos de 18 mm recubiertos de poli-D-lisina (0,1 mg/mL). Existen excelentes guías para la preparación de cultivos neuronales disociados.
nota: Si es necesario, los cultivos pueden tratarse con arabinósido de citosina (Ara-C, 10 μM de días in vitro 1 [DIV1]) para evitar la proliferación glial en la preparación
nota: Se pueden utilizar reactivos de recubrimiento alternativos como la fibronectina (1 mg/mL) o la laminina (5 μg/mL) en lugar de la poli-D-lisina.
- Mantener los cultivos en una incubadora celular a 37 °C y 5% de CO2 en 2 mL/pocillo de medio neurobasal suplementado con B27 y 2 mM L-glutamina.
nota: Se pueden usar sustitutos de la L-glutamina (por ejemplo, Glutamax), si se desea.
- Semanalmente, retire la mitad del volumen de medios y reemplácelos con el mismo volumen de medios neurobasales suplementados.
- OPCIONAL: Transfección de receptores mutados y/o marcados con epítopos
NOTA: Las neuronas deben transfectarse al menos 3-4 días antes del punto de tiempo del análisis para permitir la expresión del receptor. El uso de neuronas jóvenes (DIV6-9) da como resultado una mejor eficiencia de transfección que las neuronas más viejas (DIV15-20), pero se puede lograr un número suficiente de células transfectadas (>20) independientemente de la DIV empleada.
- Para cada pocillo de una placa de 12 pocillos, diluir 1,5 μg de plásmido que contenga el constructo de interés en 100 μL de medio neurobasal fresco sin suplementación con B27 o glutamina en un tubo de microcentrífuga y mezclar por vórtice rápidamente.
nota: Para una transfección exitosa, es fundamental que el medio neurobasal utilizado sea lo más fresco posible, idealmente menos de 1 semana después de la apertura del frasco.
- En un segundo tubo de microcentrífuga, mezcle 1 μL de un reactivo de lipofección adecuado en 100 μL de medio neurobasal fresco y mezcle suavemente.
nota: No haga vórtice la mezcla de reactivos de lipofección. El uso de reactivos de lipofección frescos puede mejorar la eficiencia de la transfección.
- Incubar los tubos durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
- Agregue la mezcla de reactivos de lipofectión gota a gota a la mezcla de ADN, mezcle suavemente e incube durante 20 minutos a RT.
- Ajuste el volumen de los medios en cada pocillo a 1 mL de medios acondicionados.
- Agregue el reactivo de lipofección y la mezcla de ADN gota a gota al pocillo.
- Regrese las células a la incubadora y espere al menos 3-4 días para la expresión de la proteína.
nota: A los efectos de los protocolos de internalización y reciclaje que se describen a continuación, se transfectaron neuronas del hipocampo en DIV11-12 con construcciones que expresaban GluN2B marcadas con proteína fluorescente verde (GFP) en el dominio extracelular (GFP-GluN2B) y se obtuvieron imágenes en DIV15-16.
- OPCIONAL: Incubación de células con fármacos (de forma crónica o aguda) en el medio condicionado hasta su fijación.
NOTA: Para el tratamiento agudo, comience a tratar las células antes de etiquetarlas. Dependiendo del protocolo de tratamiento farmacológico utilizado, las células pueden mantenerse en medios que contengan fármaco durante la sección 2. En nuestro ejemplo, las células DIV21 se sometieron a un protocolo de potenciación a largo plazo inducida químicamente (cLTP) para aumentar el receptor de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico (AMPAR) expresado en la superficie.
- Cambie los medios acondicionados por solución extracelular (ECS).
- Trate las células con 300 μM de glicina en ECS durante 3 min en RT. Como control, trate un cubreobjetos hermano con ECS (sin glicina).
- Lave las células 3 veces con ECS a 37 °C y devuelva las células en ECS (sin glicina) a la incubadora de células durante 20 minutos antes de continuar con la sección 2.
NOTA: ECS (en mM): 150 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCl, 10 ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES), 30 glucosa, 0,001 tetrodotoxina (TTX), 0,01 estricnina y 0,03 picrotoxina a pH 7,4.
>2. Marcaje en vivo de receptores expresados en superficie
- Prepare las cubreobjetos para etiquetar
- Para ahorrar reactivos y facilitar la manipulación, transfiera los cubreobjetos con el lado de la célula hacia arriba a una bandeja cubierta con película de parafina.
NOTA: Es fundamental no dejar que las muestras se sequen.
- Guarde y mantenga los medios acondicionados a 37 °C para las etapas de incubación y lavado.
nota: Para un cubreobjetos de 18 mm, se recomienda la incubación con 75-100 μL de medio para el marcaje de anticuerpos y 120-150 μL para la internalización/reciclaje.
- Marcaje de receptores de superficie con anticuerpo primario
- Incubar células con anticuerpo primario diluido en medios acondicionados durante 15 min a RT.
nota: Para los receptores marcados con GFP, se utilizó un anticuerpo anti-GFP de conejo a una dilución de 1:1000. Para la GluA1 endógena, se utilizó anti-GluA1 de ratón en una dilución de 1:200.
- Aspire cuidadosamente los medios que contienen anticuerpos con una pipeta de vacío y lave las células tres veces con medios acondicionados.
nota: Si no se dispone de medios acondicionados, todos los pasos de lavado pueden realizarse con PBS+ [solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 1 mM MgCl2 y 0,1 mM CaCl2]. La aspiración manual con una micropipeta se puede realizar si no se dispone de una aspiración endouterina suave.
>3. Expresión de superficie (Figura 1)
- Marcaje secundario de anticuerpos de receptores expresados en superficie
- Lavar una vez con PBS+.
- Fije las células incubando con un 4% de paraformaldehído (PFA) y un 4% de sacarosa en PBS durante 7-8 min.
nota: A diferencia de otros métodos de fijación, como la incubación de metanol, el PFA no permeabiliza la membrana plasmática y, por lo tanto, es adecuado para el análisis de expresión superficial. Para obtener resultados óptimos, utilice PFA recién preparado. El almacenamiento a corto plazo de PFA a 4 °C o el almacenamiento a largo plazo (hasta 30 días) a -20 °C es permisivo para una fijación adecuada.
cautela: El PFA es un carcinógeno conocido. Utilice el equipo de protección personal adecuado y una capucha de seguridad al manipular.
- Lave las celdas tres veces con PBS.
nota: Alternativamente, se puede usar glicina 0.1 M para lavar PFA en lugar de PBS, ya que la glicina apagará cualquier fijador restante que pueda aumentar el fondo en la preparación.
- Bloquee los sitios de unión inespecíficos incubando con 10% de suero de cabra normal (NGS) en PBS durante 30 min a RT.
nota: El tiempo de bloqueo se puede extender sin efectos adversos en el etiquetado.
- Incubar con anticuerpo secundario marcado con fluorescencia diluido en NGS al 3% en PBS durante 1 h en RT para marcar los receptores marcados con anticuerpos primarios (es decir, expresados en superficie).
nota: En estos ejemplos, se utilizó una dilución 1:500 de anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 555: cabra anti-conejo para los receptores marcados con GFP y cabra anti-ratón para GluA1.
- Lave las celdas con PBS 3x.
- Marcaje de receptores intracelulares
- Permeabilice las células con Triton X-100 al 0,25 % en PBS durante 5 a 10 minutos en RT.
nota: Para comprobar que la ronda inicial de marcaje de anticuerpos ocupa todos los epítopos de la superficie, este paso de permeabilización se puede omitir en un cultivo hermano. En este caso, no se debe obtener ninguna señal para los receptores intracelulares. Además, para comprobar que no se han marcado receptores internos en la sección 2 anterior (es decir, que muestran la integridad de las membranas plasmáticas en cultivo), se puede omitir el paso de permeabilización en un cultivo hermano, y se puede utilizar un anticuerpo primario contra una proteína intracelular (por ejemplo, la proteína de densidad postsináptica 95 [PSD-95] o la proteína 2 asociada a microtúbulos [MAP2]) en el paso 2.2.1. No se debe obtener ninguna señal de este primario en estas condiciones. En este caso, se utilizó un anticuerpo anti-PSD-95 de conejo (1:500).
- Bloque con 10% de NGS en PBS durante 30 min en RT.
- Marcaje de receptores intracelulares mediante la incubación de células permeabilizadas con el mismo anticuerpo primario utilizado en la sección 2.2 diluido en NGS al 3% en PBS durante 1 h a RT.
nota: La dilución de anticuerpos para el marcaje de receptores intracelulares puede ser diferente de la requerida para el marcaje de receptores expresados en superficie. En el ejemplo de GluA1, se utilizó la misma dilución de anticuerpos (1:200).
- Lave las celdas 3 veces con PBS.
- Marcaje con segundo anticuerpo secundario marcado con fluorescencia diluido en NGS al 3% en PBS durante 1 h a RT.
nota: En estos ejemplos, se utilizó una dilución 1:500 del anticuerpo secundario conjugado Alexa 647 (para GluA1) anti-ratón de cabra.
- Lave las celdas 3 veces con PBS.
>4. Internalización (Figura 2)
- Internalización de receptores de superficie marcados con anticuerpos
- Después del marcaje de los receptores expresados en superficie y el lavado de anticuerpos (sección 2.2), mantenga las células en medios acondicionados sin anticuerpos y devuélvalas a la incubadora (37 °C) para permitir la internalización.
NOTA: Para los receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA), se recomiendan 30 minutos para la internalización. Como control, se puede mantener un cultivo hermano con medios acondicionados a 4 °C durante el proceso de internalización. En estas condiciones, la internalización mínima del receptor debería ocurrir.
- Marcaje de receptores de superficie
- Lave las celdas una vez con PBS+.
- Fije las células con 4% de PFA y 4% de sacarosa en PBS durante 7–8 min.
cautela: Use el equipo de protección personal adecuado y una capucha de seguridad cuando manipule PFA.
- Lave las celdas 3 veces con PBS regular.
- Bloquee con 10% de NGS en PBS durante 30 min en RT para evitar el enlace inespecífico.
- Incubar muestras con anticuerpo secundario marcado con fluorescencia diluido en NGS al 3% en PBS durante 1 h en RT para marcar receptores primarios marcados con anticuerpos (es decir, receptores expresados en superficie que no fueron internalizados).
nota: Para este ejemplo, se utilizó el anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado Alexa 555 (1:500) para el etiquetado.
- Lave las celdas 3 veces con PBS.
- Marcaje de receptores internalizados
- Permeabilice las células con Triton X-100 al 0,25 % en PBS durante 5 a 10 minutos.
- Bloquear la unión inespecífica mediante incubación con NGS al 10% en PBS durante 30 min en RT.
- Incubar muestras con anticuerpo secundario marcado con fluorescencia diluido en NGS al 3% en PBS durante 1 h en RT para marcar los receptores marcados con anticuerpos internalizados.
nota: Para este ejemplo, se utiliza el anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado Alexa 647 (1:500) para el etiquetado.
- Lave las celdas 3 veces con PBS.
>5. Reciclaje (Figura 3)
- Internalización de receptores de superficie marcados con anticuerpos
- Después del marcaje de los receptores expresados en superficie y el lavado de anticuerpos (sección 2.2), mantenga las células en medios acondicionados sin anticuerpos y devuélvalas a la incubadora (37 °C) para permitir la internalización.
NOTA: Para los receptores NMDA, se recomiendan 30 minutos para la internalización.
- Bloqueo de receptores expresados de superficie estable
- Para bloquear los epítopos del anticuerpo primario unido a los receptores expresados en superficie que no se han internalizado, se incuban células con fragmentos de anticuerpos Fab anti-IgG (H+L) no conjugados (frente al primario utilizado en la sección 2.2) diluidos en medios condicionados (20 μg/mL) durante 20 min a RT. Este tratamiento evita la interacción futura con anticuerpos secundarios.
nota: Para este ejemplo, se utilizaron fragmentos de Fab anti-conejo de cabra.
nota: Experimento de control: para asegurarse de que se ha producido el bloqueo completo de los receptores expresados en la superficie, se pueden incubar cubreobjetos hermanos con y sin Fab. Los cultivos deben fijarse inmediatamente después del tratamiento con Fab, y ambos cultivos se incuban con el anticuerpo secundario conjugado con Alexa 555. Ninguna señal de Alexa 555 en las células incubadas por Fab indica un bloqueo adecuado de anticuerpos.
- Lave las celdas 3 veces con medios acondicionados.
- Incubar las células con medios acondicionados que contengan 80 μM de dinasore para evitar una mayor internalización y devolver las células a la incubadora (37 °C) para permitir el reciclaje de los receptores internalizados. Dynasore es un inhibidor de la GTPasa que inhibe la dinamina y, por lo tanto, evita la internalización.
NOTA: Se recomiendan 45 minutos para el reciclaje NMDAR. Tenga en cuenta que Dynasore bloquea exclusivamente el proceso de internalización dependiente de la dinamina (por ejemplo, la internalización de NMDAR). Sin embargo, la internalización de otras proteínas sinápticas (independientes de la dinamina) aún puede ocurrir en presencia de Dynasore.
- Etiquetado de receptores reciclados
- Lave las celdas una vez con PBS+.
- Fije las células con 4% de PFA y 4% de sacarosa en PBS durante 7–8 min.
cautela: Use el equipo de protección personal adecuado y una capucha de seguridad cuando manipule PFA.
- Lave las celdas 3 veces con PBS.
- Bloquee con 10% de NGS en PBS durante 30 min en RT para evitar el enlace inespecífico.
- Células marcadas con el primer anticuerpo secundario marcado con fluorescencia diluido en NGS al 3% en PBS durante 1 h a RT.
nota: Para este ejemplo, se utilizó el anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado Alexa 555 (1:500) para el etiquetado.
- Lave las celdas 3 veces con PBS.
nota: Los lavados más largos con PBS (5-10 min) pueden ayudar a reducir el fondo de la preparación.
- Marcaje de receptores internalizados
- Permeabilice las células con Triton X-100 al 0,25 % en PBS durante 5 a 10 minutos.
- Bloque con 10% de NGS en PBS durante 30 min en RT.
- Marcaje con segundo anticuerpo secundario marcado con fluorescencia diluido en NGS al 3% en PBS durante 1 h a RT.
nota: Para este ejemplo, se utilizó el anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado Alexa 647 (1:500) para el etiquetado.
- Lave las celdas 3 veces con PBS.
>6. Montaje y obtención de imágenes de muestras
- Monte las celdas colocando suavemente los cubreobjetos con el lado de la celda hacia abajo sobre 12-15 μL del medio de montaje adecuado.
nota: La aspiración del exceso de medios de montaje mejorará la calidad de las imágenes.
- Imagen de las células en un microscopio confocal apropiado.
nota: Se recomienda obtener una imagen de una pila z con un aumento de 60x con pasos de 0,35 μm, que abarque todo el grosor de la neurona.
>7. Consideraciones de tiempo
- Se trata de un protocolo largo que se puede detener en varios puntos. Si lo desea, realice las etapas de bloqueo e incubación primaria de anticuerpos durante la noche a 4 °C en una cámara húmeda.
- Alternativamente, si lo desea, use un procesador de pañuelos de microondas para acelerar enormemente los tiempos de incubación posteriores a la fijación. Para todos los pasos, utilice 150 W a 30 °C para los ajustes "On".
- Para bloquear, ejecute el procesador a 2 minutos "Encendido", 1 minuto "Apagado" y 2 minutos "Encendido".
- Para los pasos de incubación de anticuerpos primarios y secundarios, haga funcionar el procesador a 3 minutos "Encendido", 2 minutos "Apagado" y 3 minutos "Encendido".
NOTA: No observamos ninguna diferencia en la calidad al realizar las modificaciones anteriores en el protocolo.
>8. Análisis de imagen
- Se recomienda utilizar FIJI para realizar análisis de imágenes, ya que es compatible con múltiples formatos de archivo. Para nuestros datos, se adquirieron imágenes en el formato de archivo Nikon ND2.
- Se proporciona un script de macros para facilitar la cuantificación por lotes de diferentes parámetros preseleccionados por FIJI. Los siguientes pasos se incluyen en la macro:
NOTA: Para estos ejemplos, se midió la "intensidad integrada".
- Abra los archivos de imagen en FIJI y separe los canales.
- Proyección Z de cada pila de canales como una proyección de intensidad máxima.
- Establezca un umbral inferior para cada canal.
NOTA: Los umbrales deben determinarse empíricamente para cada conjunto de datos experimentales. Si bien cada canal puede tener un valor de umbral inferior independiente, es crucial que los valores de umbral del canal se mantengan de manera coherente para todas las imágenes del mismo conjunto de datos.
- Seleccione de tres a cinco dendritas secundarias o terciarias y guárdelas como regiones de interés (ROI).
- Mida la densidad integrada de cada ROI en canales superficiales e intracelulares.
- Normalice la señal para cada ROI dividiendo el valor de densidad integrada del canal de superficie por el canal intracelular.
- Repita las mediciones para todas las imágenes experimentales y de control y normalice los valores experimentales a valores de control (p. ej., condiciones de GluN2B WT o sin glicina).
