Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Preparación de la microesfera objetivo
- Seleccione un antígeno diana relevante.
nota: En este ejemplo, se utilizó la proteína recombinante V1V2-2F5K, que se diseñó para imitar el ápice trimérico de la envoltura nativa del VIH.
- Realizar la biotinilación utilizando un kit comercial (Tabla de Materiales) según el protocolo del fabricante.
- Calcule los mmol del reactivo de biotina para agregar a la reacción para obtener un exceso molar de 5 veces usando la fórmula: mmol de biotina = mL de proteína x (mg de proteína/mL de proteína) x (mmol de biotina/mg de proteína) x (5 mmol de biotina/mmol de proteína). A continuación, calcule μL del reactivo de biotina para añadir utilizando la fórmula: μL de biotina = mmol de biotina x (1.000.000 μL/L) x (L/10 mmol).
- Equilibre la biotina a temperatura ambiente antes de abrirla. Disuelva la proteína en 0,5-2,0 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) de acuerdo con el cálculo realizado anteriormente.
- Prepare una solución de 10 mM de reactivo de biotina en dimetilsulfóxido (DMSO) y agregue el volumen apropiado de 10 mM de reactivo de biotina a la solución de proteína, e incube la reacción en hielo durante 2 h o a temperatura ambiente durante 30 min.
- Eliminar el exceso de biotina utilizando concentradores de proteínas (membranas de polietersulfona [PES], corte de peso molecular [MWCO] de 3 kDa, 0,5 mL; Tabla de Materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Deposite la muestra en la cámara superior de la columna de centrifugación y agregue PBS hasta 400 μL. Cap, luego inserte esta cámara de muestra en un tubo de recolección. Centrifugar a 12.000 x g a temperatura ambiente durante 30 min.
- Deseche el flujo continuo y agregue PBS a 400 μL. Repita la centrifugación. Deseche el flujo continuo y agregue PBS a 100 μL. Mida la concentración de proteínas con un espectrofotómetro.
nota: La proteína se puede alícuota y congelar a -80 °C hasta su uso.
>2. Preparación de la placa del ensayo de fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP)
- Proteína biotinilada conjugada con microesferas de 1 μm («perlas»; Tabla de Materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Por plato de perlas conjugadas, incubar 6 μg de proteína con 12 μL de perlas de caldo en 200 μL de albúmina sérica bovina (BSA)-PBS al 0,1% a temperatura ambiente durante 1 h, vórtice suavemente cada 20 min.
- Centrifugar a 13.000 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante, el vórtice suavemente y vuelva a suspender en 1200 μL de BSA-PBS al 0,1%. Repita el paso de centrifugado y lavado 2 veces. Volver a suspender en 1200 μL de BSA-PBS al 0,1%.
- Alícuota 10 μL de solución de perlas por pocillo en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Prepare diluciones de anticuerpos o sueros inmunes de interés en 12 μL de HSA HBSS al 2%, generalmente comenzando con 50 μg/mL de anticuerpo o una dilución de suero de 1/100.
nota: En los datos de la muestra se utilizó el anticuerpo monoclonal (mAb) 830A.
- Añadir 10 μL de anticuerpo/suero titulado a la placa de bolas e incubar durante 2 h a 37 °C. Añadir 200 μL de HSA HBSS al 2% a cada pocillo y centrifugar la placa a 2.000 x g durante 10 min.
- Retire con cuidado el sobrenadante mediante un rápido vuelco y decantación del líquido de los pozos de la placa en un fregadero para evitar perturbar la bolita de cuentas invisible.
>3. Aislamiento de las células de la leche materna
- Obtener leche materna humana de mujeres lactantes sanas, extraída mediante doble bomba electrónica o manual. Aísle las células dentro de ~ 4 h de la extracción, manteniendo la leche a temperatura ambiente.
- Con tubos de 50 ml, centrifugar 50 ml de leche a 800 x g durante 15 min. Vierta con cuidado la leche descremada y la grasa sin tocar la pastilla celular. Limpie el interior del tubo con una toallita sin pelusa para eliminar toda la grasa de la pared del tubo.
- Añadir 10 mL de albúmina sérica humana al 2% en la solución salina equilibrada de Hank (HSA HBSS al 2% [sin Ca2+ o Mg+]). Vuelva a suspender el pellet mediante un pipeteo suave para evitar la activación celular y la apoptosis. Transfiera a un tubo de 15 mL y centrifugue a 450 x g durante 10 min.
- Vierta el sobrenadante y repita el paso 1.3. A continuación, resuspenda suavemente las células en 1-2 mL de HSA HBSS al 2% en función del número de células esperado, y cuente las células con un hemocitómetro o un contador de células automatizado, teniendo en cuenta también la viabilidad de la célula.
4. Ensayo ADCP
NOTA: Los métodos descritos aquí son adaptados de Ackerman et al.
- Añada 50.000 células BM recién aisladas a cada pocillo de la placa de ensayo ADCP en 200 μL de HSA-HBSS al 2%. Incubar durante 2 h a 37 °C.
- Para los experimentos de control, preincubar las células a 37 °C con 10 μg/mL de inhibidor de actina (citocalasina-D), 50 μg/mL de agente bloqueante del receptor Fc (FcBlock), o una combinación de ambos antes de su adición a las placas.
- Placa centrífuga a 930 x g durante 10 min. Añadir 200 μL de HSA HBSS al 2% y repetir la centrifugación. Retire con cuidado el sobrenadante como en el paso 2.7 y repita el lavado.
- Retire cuidadosamente el sobrenadante y las células de tinción para verificar su viabilidad utilizando una tinción de viabilidad fijable de 0,5 μg/mL (concentración final) 450 por pocillo en 50 μL de HSA HBSS al 2%. Incubar 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Centrifugar la placa a 930 x g durante 10 min y eliminar el sobrenadante como en el paso 2.7. Añada 200 μL de HSA HBSS al 2% y vuelva a centrifugar la placa, seguido de la eliminación del sobrenadante como en el paso 2.7.
- Después de la tinción de viabilidad, tiña las células para los marcadores leucocitarios de interés, incluyendo mínimamente una tinción específica de CD45 como PE-ratón anti-CD45 humano (clon HI30) a una concentración optimizada (1 μg/μL en 50 μL de 1% BSA HBSS en los datos de ejemplo)
nota: Se puede incluir cualquier marcador de interés específico del linaje.
- Incubar 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Centrifugar la placa a 930 x g durante 10 min y eliminar el sobrenadante como en el paso 2.7. Añadir 200 μL de BSA HBSS al 1% y repetir la centrifugación. Retire el sobrenadante. Fije las celdas en 200 μL de formaldehído al 0,5% en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos o toda la noche a 4 °C. Refrigere en la oscuridad hasta el análisis.
>5. Análisis por citometría de flujo
- Realice la compuerta inicial para eliminar los dobletes en un gráfico de dispersión directa (FSC) frente a dispersión lateral (SSC) y los desechos (material menor que FSC = 5000) (consulte la Figura 1). Utilice un gráfico de SSC frente a tinción de viabilidad (V450 en este caso) para eliminar las células muertas (aquellas que son positivas para la tinción de viabilidad).
- Utilice una gráfica SSC vs. CD45 para diferenciar las principales clases de leucocitos (granulocitos, monocitos, linfocitos) como se describe ampliamente.
nota: Esta clasificación solo es sugestiva y se necesitan marcadores específicos del linaje para confirmar el tipo de célula.
- Para todas las células CD45+, o para cada subconjunto de leucocitos de interés, se mide la actividad de ADCP mediante la compuerta con un marcador en las células positivas para perlas en un histograma del canal de isotiocianato de fluoresceína (FITC), donde se detectan las perlas fluorescentes
nota: Los pocillos de control negativo en los que no se agregaron perlas indicarán dónde son visibles las celdas positivas de perlas en el histograma y, por lo tanto, dónde colocar el marcador de compuerta.
- Calcule las puntuaciones de ADCP como (mediana de la intensidad de fluorescencia [MFI] de las células positivas para perlas) x (% del total de células CD45+ en la población positiva). Utilice software gráfico para trazar las puntuaciones en cada concentración de Ab/suero y para realizar un análisis de área bajo la curva (AUC).
nota: El ADCP se considera positivo si el AUC es superior a 3 veces la desviación estándar del AUC de la puntuación ADCP de un mAb de control negativo inespecífico (en este caso, 3865).
