Un ensayo in vitro para medir la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos por fagocitos

Resumen

Fuente: Powell, R. L., et al. Aislamiento de leucocitos de la leche materna humana para su uso en un ensayo de fagocitosis celular dependiente de anticuerpos de objetivos del VIH. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra un ensayo para medir la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) por fagocitos de la leche materna. Las microesferas marcadas con fluorescencia conjugadas en un complejo antígeno-anticuerpo se combinan con una suspensión celular aislada de la leche materna para inducir la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos por los leucocitos fagocíticos. Al marcar las células con anticuerpos contra el antígeno leucocitario común (CD45), se utiliza la citometría de flujo para medir la intensidad de fluorescencia de los leucocitos fagocíticos viables positivos para microesferas, lo que indica el nivel de actividad de ADCP.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Preparación de la microesfera objetivo

1. Seleccione un antígeno diana relevante.
   nota: En este ejemplo, se utilizó la proteína recombinante V1V2-2F5K, que se diseñó para imitar el ápice trimérico de la envoltura nativa del VIH.
2. Realizar la biotinilación utilizando un kit comercial (Tabla de Materiales) según el protocolo del fabricante.
   1. Calcule los mmol del reactivo de biotina para agregar a la reacción para obt....

Resultados

Figura 1: Muestra de datos de citometría de flujo de células aisladas de leche materna. Las células se procesaron y tiñeron como se describe en el protocolo. (A) Se cerraron celdas individuales para eliminar dobletes en una parcela FSC-H vs. FSC-A como se muestra, también se cerraron los pequeños restos <5,000 en FSC-A. (B) Esta población se utilizó para compuerta.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microesferas marcadas con NeutrAvidin de 1 μm	Termo Fisher	F8776
BD Pharmingen PE Ratón Anti-Humano CD45	Bd	560975
Albúmina de suero bovino	MP Biomedicals	8810025
Placa de poliestireno de 96 pocillos con fondo en V de Corning	Corning	3894
Citocalasina D	sigma	22144-77-0
Kit de biotina EZ-Link NHS-LC-LC	Termo Fisher	21338
Tubos de centrífuga cónicos Falcon 15mL	Corning	352196
Tubos de centrífuga cónicos Falcon 50mL	Corning	352070
Mancha de viabilidad reparable 450	Bd	562247
Solución de formaldehído	sigma	252549
HBSS sin Calcio, Magnesio o Rojo Fenol	Tecnologías de la Vida	14175-095
Bloque BD Fc Humano	Bd	564219
Albúmina sérica humana	MP Biomedicals	2191349
Kimtech Science Kimwipes Limpiaparabrisas para tareas delicadas	Kimberly-Clark Profesional	34120
PBS 1x pH 7.4	Termo Fisher	10010023
Pipetas serológicas de poliestireno 10mL	Corning	4488
Concentradores de proteínas PES, 3K MWCO, 0.5 mL	perforar	88512