Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de células inmunitarias del bazo de ratón
>NOTA: Aplicar la eutanasia a ratones ingenuos con dióxido de carbono (CO2). Los ratones C57BL/6 comprados en Jackson Laboratories y criados internamente se utilizan para experimentos entre las 6 y las 12 semanas de edad. Tanto los ratones machos como las hembras se utilizan para los experimentos.
- Desinfecte la piel del ratón con etanol al 70% para reducir la posibilidad de que los contaminantes externos entren en la muestra.
- Disecciona el bazo del ratón con herramientas de disección, tijeras quirúrgicas y fórceps. Extraiga el bazo y coloque el bazo desprendido en un tubo cónico de 50 mL con ~ 5 mL de medios completos del Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) en hielo.
nota: El RPMI completo está compuesto por un 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina y un 1% de penicilina/estreptomicina.
- Para extraer el bazo del ratón, haga una incisión de 5 cm en el pelaje y la piel a lo largo del lado izquierdo del ratón a medio camino entre las patas delanteras y traseras con unas tijeras. Abra la cavidad corporal ~ 5 cm y retire el bazo con pinzas. El bazo es del color de un frijol y es más largo y plano que el riñón vecino.
- Vierta el contenido del paso 1.2 en un filtro estéril de 70 μm conectado a un nuevo tubo cónico de 50 mL. Separe mecánicamente el bazo en una suspensión de una sola celda empujando el bazo a través del filtro con un émbolo de jeringa de 5 ml hasta que no quede pulpa de bazo en la superficie del filtro.
- Granular los esplenocitos utilizando una centrífuga de encimera de rotor oscilante a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
- Decanta cuidadosamente el sobrenadante. Los esplenocitos granulados permanecen en el fondo del tubo cónico de 50 mL.
- Para eliminar los glóbulos rojos, vuelva a suspender los esplenocitos peletizados en 1 ml de tampón de lisis de amonio-cloruro-potasio (ACK) durante 3 minutos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mezclar bien.
- Apague el tampón de lisis ACK con 15 mL de cRPMI.
- Granule los linfocitos como se indica en el paso 1.4.
- Vuelva a suspender la suspensión celular en 5 mL de cRPMI en un tubo cónico de 50 mL. Coloque las muestras en hielo.
- Para contar las células, transfiera 10 μL de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 0,6 mL y diluya en una proporción de 1:1 con una solución de azul de tripán. Luego, transfiéralo a un hemocitómetro o a un sistema automatizado de conteo de células.
- Después del recuento, dependiendo de la concentración celular en la suspensión celular como en el paso 1.9, granule las celdas en una centrífuga de mesa a 500 x g a 4 °C durante 5 min para prepararse para la adición de medios cRMPI que contengan colorante éster Indo-1 AM.
- Calcule el volumen para la resuspensión de las células para lograr 10-12 x 106 células/mL. Esta es una concentración 2 veces mayor del recuento total de células requerido.
- Vuelva a suspender las celdas en el volumen de cRPMI calculado en el paso 1.11. Coloque las células a 37 °C con 5% de CO2 en un tubo cónico de 50 mL con la tapa ventilada o en una placa de cultivo de tejidos.
>2. Colorante radiométrico Indo-1 y marcaje de anticuerpos fluorescentes
- Según las instrucciones del fabricante, agregue 50 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) en un vial que contenga 50 μg de Indo-1 AM. La concentración de la solución madre es de 1 μg/μL.
nota: El DMSO se suministra en microviales con el kit para evitar cualquier oxidación del DMSO.
- Diluir la alícuota madre (1 μg/μL) en el volumen experimental apropiado (establecido en 1.11) de cRPMI a una concentración de 6 μg/mL, una concentración 2x. No almacene Indo-1 en una solución acuosa.
nota: Se pueden utilizar otros tampones con calcio añadido en función de las necesidades de la célula.
- Coloque el medio completo con Indo-1 a un lado en un baño de agua a 37 °C.
nota: Utilice la concentración mínima de éster de Indo-1 AM necesaria para obtener una señal adecuada. Esto debe valorarse para los diferentes tipos de células. Por lo general, una concentración entre 3 y 5 μM es suficiente. En el caso de las células T primarias, la carga de células con Indo-1 a una concentración >5 μg/mL aumenta la intensidad fluorescente media (MFI) por encima de un logaritmo de 6 en los citómetros de flujo espectral. Si esto ocurre, disminuya la intensidad del láser ultravioleta (UV) y ajuste el Indo-1 a una concentración más baja.
- Diluir la suspensión celular previamente preparada (en el paso 1.12), 1:1 en cRPMI, incluyendo los medios 2x Indo-1 fabricados en el paso 2.2. Asegúrese de que las células estén en una concentración entre 5-6 x 106/mL.
nota: No cargue el tinte de control de tinción única sin teñir o los controles de celda de tinción única de marcador de superficie con Indo-1. La adición de Indo-1 a los controles de anticuerpos de tinción única creará una muestra multicolor debido a que el Indo-1 se agrega a las células teñidas individuales. Incluya ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) indo-1 (libre de calcio) añadido a la placa de muestra creada en el paso 2.6.
- Agregue 1 mL de células/pocillo/condición experimental en una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos.
- Cree un único control teñido para la muestra de Indo-1 (sin calcio) utilizando células previamente cargadas con colorante Indo-1 y añada EGTA a una concentración final de 2 mM. EGTA quemará el calcio en la suspensión celular, proporcionando una muestra de control más limpia.
- Cree un control positivo de Indo-1 (Indo-1 unido al calcio) agregando 50 μM de ionomicina a la suspensión celular cargada de colorante en el citómetro de flujo. La ionomicina es un ionóforo de calcio permeable a la membrana que se une a los iones de calcio y facilita la transferencia de iones de calcio a las células.
- Cree un pozo para el control biológico negativo sin fluoróforos ni colorante Indo-1.
- Cree un pocillo para controles de tinción única para cualquier población celular adicional de interés (anticuerpos definidos por el usuario) utilizando fluoróforos conjugados con anticuerpos en un diseño de panel de citometría de flujo. Estos no incluirán el tinte radiométrico Indo-1.
- Agregue el anticuerpo bloqueador del receptor Fc (~2 μg/1 x 106 células), según las instrucciones del fabricante, antes de agregar anticuerpos conjugados con fluorocromo adicionales para la tinción de superficies.
- Incubar la placa durante 45 min a 37 °C con 5% de CO2.
- Vuelva a suspender las células en una placa de 12 pocillos golpeando suavemente la placa cada 15 minutos.
- Mezcle y retire todo el volumen de células suspendidas en el medio de la placa de 12 pocillos. A continuación, añada la suspensión celular a los tubos de microcentrífuga de 1,7 mL.
- Granular las células en una microcentrífuga a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Decantar el sobrenadante y lavar las células añadiendo 1 mL de cRPMI precalentado. Pellet de nuevo y decantar el sobrenadante.
nota: El lavado de las células elimina cualquier anticuerpo bloqueante Fc restante.
- Vuelva a suspender las células en 1 mL de cRPMI en tubos de microcentrífuga de 1,7 mL e incube cada tubo a 37 °C durante 30 min adicionales con 5% de CO2, dejando la parte superior del tubo ligeramente abierta para permitir el intercambio de gases. Esto permite la desesterificación completa de los ésteres intracelulares de AM.
- Transfiera las células de nuevo a una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos, si es necesario. Se pueden agregar anticuerpos conjugados con fluorocromo titulados definidos por el usuario adicionales en una fase de reposo.
nota: Los marcadores utilizados en el panel de métodos incluyen: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 y CD1d/α-galcer tetrámero. Los marcadores se eligen para analizar los subconjuntos de células T.
- Cree una mezcla maestra de todos los anticuerpos conjugados con fluorocromo definidos por el usuario de acuerdo con los tipos de células de interés a un volumen previamente titulado en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
- Agregue una mezcla maestra calculada para 1 mL del volumen celular, dependiendo de los anticuerpos titulados contra las células en reposo.
nota: La ventaja de la tinción en el paso 2.15 en lugar del paso posterior 2.18 es que la tinción en el paso 2.15 disminuirá el tiempo total de incubación del experimento. Sin embargo, la tinción en un volumen total de 1 mL en el paso 2.15 aumenta el uso de anticuerpos.
- Después del reposo, granule las células a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
nota: Las células en una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos se pueden peletizar en la placa con un accesorio de centrífuga de placa. De lo contrario, granule las células en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
- Lave las células resuspendiendo el pellet en 1 mL de cRPMI frío a 4 °C y vuelva a granular las celdas como en el paso 2.16. Coloque las celdas en hielo.
nota: Si se tiñen las células de superficie por separado, después de la desesterificación en el paso 2.18, se necesita menos volumen de anticuerpos. La tinción de la superficie en este paso se puede realizar después de la fase de reposo en tampón de flujo frío (1x solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco con 1% de FBS añadido), utilizando anticuerpos definidos por el usuario, en hielo durante 30 min. Lave las células después de la tinción en cRPMI como en el paso 2.17.
- Añada la mancha de viabilidad Ghost540 diluida 1:7.500 en DPBS a las muestras de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El calor mata las células a 55 °C en un bloque de calentamiento para el control de vivos/muertos con una sola tinción.
nota: La tinción con colorante funcional de viabilidad para eliminar las células muertas en el análisis de citometría de flujo se realiza sin FBS. FBS puede interactuar con los tintes de amina según las instrucciones del fabricante.
- Vuelva a suspender muestras individuales en 500 μL de cRPMI (sin rojo de fenol) utilizando un tubo de flujo de poliestireno de 5 mL con tapón.
nota: Las células se pueden dejar a 4 °C hasta una hora.
- Calentar cada tubo de 5 mL que contiene células, individualmente, a 37 °C utilizando un baño de perlas durante 7 minutos antes del análisis en el citómetro de flujo, manteniendo el tiempo constante entre las muestras. Usa un temporizador.
3. Tubo de baño de perlas: mantenimiento de la temperatura durante el análisis del flujo de calcio
- Agregue las perlas de baño a un pequeño baño de agua sin agregar agua; caliente hasta 37 ° C.
- Corta cuidadosamente un tubo cónico de 50 mL por la mitad, en la marca de 25 mL, con una cuchilla de afeitar; desecha la parte superior del tubo.
- Llene el tubo cortado por la mitad 3/4 del camino con cuentas de baño.
- Coloque el tubo creado en el paso 3.2 en el baño de cuentas creado en el paso 3.1. Lleve el tubo y las perlas a 37 °C.
- Conecte el baño de perlas a una toma de corriente junto al citómetro de flujo para mantener la temperatura en preparación para el análisis de la muestra.
- Agregue un corte de rejilla cónica de espuma de poliestireno de 50 mL para sostener un tubo y colocar el tubo en su lugar mientras funciona con el citómetro de flujo. Esto eliminará la necesidad de sujetar manualmente el tubo durante el análisis de la curva.
