Un ensayo para cuantificar la unión de las VLP del norovirus humano a las bacterias intestinales

Resumen

Fuente: Madrigal, J. L., et al. Cuantificación de partículas similares al virus del norovirus humano que se unen a bacterias comensales mediante citometría de flujo. J. Vis. Exp. (2020).

Este video muestra un ensayo para cuantificar las partículas similares al virus del norovirus humano (VLP) que se unen a las bacterias intestinales humanas. Las suspensiones bacterianas se mezclan con las VLP y se incuban para permitir la formación de complejos VLP-bacterias. A continuación, los complejos se marcan con anticuerpos específicos de VLP marcados con fluoróforos, seguidos de una visualización y cuantificación basadas en citometría de flujo para identificar el porcentaje de bacterias unidas a VLP.

Protocolo

1. Ensayo de unión de bacterias VLP

>PRECAUCIÓN: Las VLP de norovirus humano son un peligro de nivel de bioseguridad (BSL)-2, y todo el trabajo que involucre VLP debe realizarse en una cabina de bioseguridad. La preparación de los cultivos bacterianos antes del ensayo de fijación debe realizarse utilizando condiciones de seguridad adecuadas para el organismo.

1. Preparación de reactivos
   1. 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS)
      1. Prepare 1 L de PBS 10x disolviendo un paquete en 1 L de agua desionizada (DI).
      2. Solución de autoclave durante 30 mi....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 ml con tapa de filtro de celdas	Corning	352235	Después de la tinción de anticuerpos, las muestras se transfieren a tubos para el análisis por citometría de flujo.
AnaeroPack	Termo Científico	R681001	Paquete de gas anaeróbico utilizado para el cultivo de Lactobacillus gasseri
Software BD FacsDiva
Citómetro de flujo BD LSR Fortessa
Albúmina sérica bovina	Biorreactivos de Fisher	BP1605	Se utiliza para la citometría de flujo
Tampón de tinción por citometría de flujo (FCSB)	BD Biociencias	554657	Se utiliza para la citometría de flujo
Ratón IgG2b kappa Control de isotipo (eBMG2b), PE, eBioscience	Thermo Fisher Scientific	12473281	Control de isotipos. Este anticuerpo se compra en forma conjugada al fabricante.
Polvo MRS	BD Biociencias	288130	Se utiliza para la preparación de medios y para el cultivo de Lactobacillus gasseri.
Anticuerpo monoclonal G2 de la cápside del norovirus (L34D)	Thermo Fisher Scientific	MA5-18241	Anticuerpo anticuerpo antivirus. Este anticuerpo solo está disponible en la forma no conjugada y, por lo tanto, debe conjugarse con fluorescencia antes de su uso en los ensayos de citometría de flujo descritos. En este protocolo, el PE fue el fluor elegido, sin embargo, se pueden elegir otras moléculas fluorescentes que mejor se adapten al citómetro de flujo que esté utilizando el investigador.
Norovirus GII.4 VLP	Bioestructura creativa	CBS-V700	Las VLP similares al virus del norovirus humano se generaron utilizando el sistema de baculovirus y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato con 10% de glicerol. Los autores realizaron un análisis de seguimiento independiente de nanosight para determinar la concentración de partículas de las VLP. La concentración es de aproximadamente 1011 VLP por mililitro. En función de la concentración de proteínas de las VLP, se añaden aproximadamente 200 partículas por bacteria en los ensayos de fijación de VLP.
PBS 10X	Biorreactivos de Fisher	BP665	Diluir a 1X antes de usar.
SiteClick R-PE Kit de etiquetado de anticuerpos	Thermo Fisher Scientific	S10467	Kit de conjugación utilizado para el labling de anticuerpos no conjugados.
cloruro de sodio	Fisher Científico	S271	Se utiliza para la preparación de medios
Triptona	Oxoide	LP0042	Se utiliza para la preparación de medios
Revólver de tubo	ThermoFisher Scientific	88881001	Se utiliza en el ensayo de unión virus:bacteria. Ajústelo a la velocidad máxima (40 rpm).
Extracto de levadura	BD Biociencias	212750	Se utiliza para la preparación de medios
agar-agar	sigma	A7002	Se utiliza para la preparación de medios