Un ensayo para cuantificar la unión de las VLP del norovirus humano a las bacterias intestinales

Resumen

Fuente: Madrigal, J. L., et al. Cuantificación de partículas similares al virus del norovirus humano que se unen a bacterias comensales mediante citometría de flujo. J. Vis. Exp. (2020).

Este video muestra un ensayo para cuantificar las partículas similares al virus del norovirus humano (VLP) que se unen a las bacterias intestinales humanas. Las suspensiones bacterianas se mezclan con las VLP y se incuban para permitir la formación de complejos VLP-bacterias. A continuación, los complejos se marcan con anticuerpos específicos de VLP marcados con fluoróforos, seguidos de una visualización y cuantificación basadas en citometría de flujo para identificar el porcentaje de bacterias unidas a VLP.

Protocolo

1. Ensayo de unión de bacterias VLP

>PRECAUCIÓN: Las VLP de norovirus humano son un peligro de nivel de bioseguridad (BSL)-2, y todo el trabajo que involucre VLP debe realizarse en una cabina de bioseguridad. La preparación de los cultivos bacterianos antes del ensayo de fijación debe realizarse utilizando condiciones de seguridad adecuadas para el organismo.

1. Preparación de reactivos
   1. 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS)
      1. Prepare 1 L de PBS 10x disolviendo un paquete en 1 L de agua desionizada (DI).
      2. Solución de autoclave durante 30 min.
      3. Prepare una solución 1x diluyendo la solución anterior 1:10 en agua desionizada.
      4. Filtro: esterilice la solución pasándola a través de un filtro de 0,22 μm y almacenándola a temperatura ambiente.
   2. 5% BSA
      1. Agregue 5 g de albúmina sérica bovina (BSA) en polvo a 100 mL de PBS para generar una solución al 5% (p/v).
      2. Mezcle la solución mediante vórtice o usando una barra de agitación de metal en una placa de agitación hasta que los grumos se hayan disuelto.
      3. Esterilizar con un filtro de 0,22 μm.
      4. Almacene la solución a 4 °C.
   3. Tampón de tinción por citometría de flujo (FCSB)
      1. Filtre el FCSB comprado (consulte la tabla de materiales) a través de un filtro de 0,22 μm.
      2. Almacene la solución restante a 4 °C.
   4. 5% Búfer de bloqueo (BB)
      nota: Prepárese fresco cada vez.
      1. Añadir 0,5 g de BSA a 10 mL de FCSB estéril.
      2. Vórtice para mezclar bien la muestra y dejar en hielo hasta su uso.
2. Conjugación de anticuerpos
   1. Conjugue el anticuerpo GII contra el norovirus humano (ver Tabla de Materiales) con r-ficoeritrina (PE) utilizando un kit de etiquetado de anticuerpos R-PE según las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales).
   2. Almacene el anticuerpo conjugado en la oscuridad a 4 °C para su uso futuro en el análisis de ensayos de unión VLP-bacteria.
      nota: El anticuerpo primario debe valorarse antes de su uso en el ensayo de unión VLP-bacteria para determinar la concentración adecuada necesaria para el análisis de citometría de flujo. La valoración de anticuerpos debe realizarse cada vez que se realiza la reacción de conjugación y para cada bacteria utilizada en el ensayo de fijación.
3. Titulación de anticuerpos
   1. Diluir el anticuerpo anti-norovirus humano conjugado GII 100 veces, con una dilución inicial de 1:100 y una dilución final de 1:600 (seis diluciones en total).
   2. Realice un ensayo de adhesión al virus como se describe a continuación con la siguiente excepción: en el paso 1.5.7, vuelva a suspender la pellet bacteriana en 350 μL de BB al 5%.
   3. Divida la muestra en siete alícuotas de 50 μL.
   4. Agregue 50 μL de cada dilución de anticuerpos a un tubo.
   5. Añadir 50 μL de BB al 5% en el séptimo tubo como control sin teñir.
   6. Realice la citometría de flujo en todas las muestras como se describe a continuación.
   7. Compare las muestras de anticuerpos diluidos con los controles no teñidos y entre sí. Se debe elegir la concentración de anticuerpos más baja que no provoque una disminución o pérdida de la señal positiva para los ensayos posteriores.
4. Preparación de bacterias
   1. Cultive las bacterias en 40 ml de medio líquido apropiado en condiciones atmosféricas adecuadas hasta que las bacterias estén en la fase estacionaria.
      1. Cultivar cultivos de Enterobacter cloacae aeróbicamente durante la noche en caldo Luria a 37 °C, agitando a 200 rpm para alcanzar la fase estacionaria.
      2. Cultive cultivos de Lactobacillus gasseri en caldo De Man, Rogosa y Sharpe (MRS) en tubos negros con tapón de rosca sin agitar en un baño de agua ajustado a 37 °C durante 18 h para alcanzar la fase estacionaria.
   2. Transfiera los cultivos en fase estacionaria a tubos cónicos limpios de 50 mL y centrifugue las muestras a 2.288 x g durante 10 min para granular las bacterias.
   3. Retirar el sobrenadante y volver a suspenderlo en 13 mL de PBS estéril 1x. Repita este paso de lavado para un total de dos lavados.
   4. Vuelva a centrifugar las muestras, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las muestras en 20 mL de 1x PBS.
      nota: Si el pellet de la celda es pequeño, se puede disminuir el volumen de resuspensión.
   5. Mida el OD₆₀₀ del cultivo.
   6. Usando una curva estándar, determine la unidad formadora de colonias (UFC) por mL del cultivo lavado.
   7. Diluya las bacterias con 1x PBS para ajustar la concentración de cultivo a 1 x 10⁸ UFC/mL.
   8. Transfiera 1 mL del cultivo bacteriano de 1 x 10⁸ UFC/mL a los tubos de centrífuga de 1,5 mL requeridos.
   9. Centrifugar los tubos a 10.000 x g durante 5 min.
   10. Vuelva a suspender el pellet bacteriano en 1 mL de BSA estéril al 5%.
   11. Incubar los tubos durante 1 h a 37 °C con rotación constante.
5. Adjunto de virus
   1. Trabajando dentro de una cabina de bioseguridad BSL-2, agregue 10 μg de VLP de norovirus humano (HuNoV) (consulte la Tabla de materiales) a cada tubo que contenga bacterias resuspendidas en PBS y mezcle bien mediante pipeteo.
      nota: La concentración de VLP difiere con cada preparación de VLP. Por lo tanto, el volumen añadido a las bacterias variará entre los lotes de preparación y debe ajustarse en consecuencia para que se añadan 10 μg a cada tubo del experimento. Para controles solo de bacterias (por ejemplo, muestras sin VLP), agregue un volumen de PBS que sea igual al volumen de VLP agregado a las muestras experimentales.
   2. Incubar los tubos durante 1 h a 37 °C con rotación constante.
      NOTA: Durante la incubación se utiliza un revólver de tubo (ver Tabla de Materiales) ajustado a 40 rpm.
   3. Después de la incubación, centrifugar las muestras a 10.000 x g durante 5 min.
   4. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet bacteriano en 1 mL de PBS.
   5. Repita los pasos de lavado 1.5.3 y 1.5.4.
   6. Centrifugar las muestras a 10.000 x g durante 5 min.
   7. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet bacteriano en 150 μL de BB al 5%.
6. Tinción de anticuerpos
   1. Prepare fresco 5% BB.
      NOTA: Todos los trabajos con el anticuerpo marcado con fluorescencia deben realizarse en la oscuridad, y el anticuerpo, BB y FCSB deben mantenerse en hielo.
   2. Diluir el anticuerpo anticuerpo GII contra el norovirus humano 1:125 para muestras de E. cloacae y 1:150 para muestras de L. gasseri en BB al 5%, preparando 50 μL de anticuerpo diluido por muestra.
   3. Diluir el anticuerpo del isotipo de la misma manera que se diluyó el anticuerpo GII del norovirus humano para cada bacteria en BB al 5%, preparando 50 μL de control de isotipo diluido por muestra.
   4. Divida cada muestra de ensayo de fijación del paso 1.3.7 en tres alícuotas de 50 μL transfiriéndolas a tubos de centrífuga limpios de 1,5 mL.
   5. Al primer conjunto de muestras, agregue 50 μL de BB. Este conjunto serán los controles sin manchar (Uns).
   6. Añadir 50 μL de la dilución de anticuerpos GII al segundo conjunto. Esto da como resultado una concentración final de anticuerpos de 1:250 para E. cloacae y de 1:300 para L. gasseri. Este conjunto de muestras serán las muestras teñidas (AB).
   7. Añadir 50 μL del anticuerpo del isotipo diluido al tercer conjunto. Este conjunto serán los controles de isotipo (IC). Mezclar bien pipeteando. Incubar las muestras en hielo y en la oscuridad durante 30 min.
   8. Centrifugar todas las muestras a 10.000 x g durante 5 min.
   9. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las muestras en 100 μL de FCSB.
   10. Centrifugar todas las muestras a 10.000 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las muestras en 100 μL de FCSB.
   11. Centrifugar todas las muestras a 10.000 x g durante 5 min.
   12. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las muestras en 150 μL de FCSB.
   13. Transfiera cada muestra a un tubo de FCSB que contenga 400 μL de tampón FCSB para un volumen total de 550 μL.
   14. Mantenga las muestras a 4 °C hasta que se analicen por citometría de flujo.
       nota: La citometría de flujo se realiza dentro de las 4 h posteriores a la tinción de anticuerpos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 ml con tapa de filtro de celdas	Corning	352235	Después de la tinción de anticuerpos, las muestras se transfieren a tubos para el análisis por citometría de flujo.
AnaeroPack	Termo Científico	R681001	Paquete de gas anaeróbico utilizado para el cultivo de Lactobacillus gasseri
Software BD FacsDiva
Citómetro de flujo BD LSR Fortessa
Albúmina sérica bovina	Biorreactivos de Fisher	BP1605	Se utiliza para la citometría de flujo
Tampón de tinción por citometría de flujo (FCSB)	BD Biociencias	554657	Se utiliza para la citometría de flujo
Ratón IgG2b kappa Control de isotipo (eBMG2b), PE, eBioscience	Thermo Fisher Scientific	12473281	Control de isotipos. Este anticuerpo se compra en forma conjugada al fabricante.
Polvo MRS	BD Biociencias	288130	Se utiliza para la preparación de medios y para el cultivo de Lactobacillus gasseri.
Anticuerpo monoclonal G2 de la cápside del norovirus (L34D)	Thermo Fisher Scientific	MA5-18241	Anticuerpo anticuerpo antivirus. Este anticuerpo solo está disponible en la forma no conjugada y, por lo tanto, debe conjugarse con fluorescencia antes de su uso en los ensayos de citometría de flujo descritos. En este protocolo, el PE fue el fluor elegido, sin embargo, se pueden elegir otras moléculas fluorescentes que mejor se adapten al citómetro de flujo que esté utilizando el investigador.
Norovirus GII.4 VLP	Bioestructura creativa	CBS-V700	Las VLP similares al virus del norovirus humano se generaron utilizando el sistema de baculovirus y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato con 10% de glicerol. Los autores realizaron un análisis de seguimiento independiente de nanosight para determinar la concentración de partículas de las VLP. La concentración es de aproximadamente 1011 VLP por mililitro. En función de la concentración de proteínas de las VLP, se añaden aproximadamente 200 partículas por bacteria en los ensayos de fijación de VLP.
PBS 10X	Biorreactivos de Fisher	BP665	Diluir a 1X antes de usar.
SiteClick R-PE Kit de etiquetado de anticuerpos	Thermo Fisher Scientific	S10467	Kit de conjugación utilizado para el labling de anticuerpos no conjugados.
cloruro de sodio	Fisher Científico	S271	Se utiliza para la preparación de medios
Triptona	Oxoide	LP0042	Se utiliza para la preparación de medios
Revólver de tubo	ThermoFisher Scientific	88881001	Se utiliza en el ensayo de unión virus:bacteria. Ajústelo a la velocidad máxima (40 rpm).
Extracto de levadura	BD Biociencias	212750	Se utiliza para la preparación de medios
agar-agar	sigma	A7002	Se utiliza para la preparación de medios