1. Detección de mitofagia en C. elegans
NOTA: El nematodo C. elegans proporciona una plataforma para analizar la mitofagia a nivel de organismo. Se pueden usar dos cepas para monitorear la mitofagia: (1) Rosella dirigida a las mitocondrias (mtRosella) o (2) receptor de mitofagia DCT-1 fusionado con GFP junto con el marcador autofagosomal LGG-1 fusionado con Discosoma sp. proteína fluorescente roja (DsRed).
- Monitorización de la mitofagia mediante el biosensor Rosella
NOTA: Rosella es un biosensor molecular que combina un DsRed insensible al pH fusionado con una variante de GFP sensible al pH. El biosensor Rosella aprovecha las diferencias de pH entre el lisosoma ácido (pH ~4,5) y otros compartimentos celulares. Este biosensor se ha utilizado para monitorear con éxito la mitofagia en Saccharomyces cerevisiae y varias líneas celulares de mamíferos, como HeLa, HEK293 y HCT116. Adaptamos este versátil reportero de doble fluorescencia y generamos nematodos transgénicos de C. elegans que expresan Rosella dirigida a las mitocondrias (mtRosella) en células musculares de la pared corporal. La inducción de la mitofagia está indicada por una relación GFP/DsRed reducida de la fluorescencia de mtRosella.
- Día 1: Elija larvas L4 de gusanos que expresen Rosella dirigida a las mitocondrias (mtRosella) en células musculares de la pared corporal en una placa de medios de crecimiento de nematodos (NGM) sembrada con E. coli (OP50) utilizando un microscopio de disección. Coloque de 10 a 20 lombrices/plato en al menos tres platos de 3,5 cm. Incubar los nematodos a la temperatura estándar de 20 °C.
nota: Consulte la referencia para la anatomía de los gusanos, incluida la identificación de las larvas L4 y la forma de hacer un pico que se utiliza para transferir gusanos de un lugar a otro.
- Día 5: Sincronice los nematodos seleccionando 15-20 larvas transgénicas L4 y transfiriéndolas a una placa NGM fresca sembrada con OP50. Utilice al menos cinco placas por condición experimental.
- Día 7: Preparar las placas de los vehículos para los medicamentos de interés que afectan a la mitofagia o los controles positivos.
- Mata las bacterias E. coli (OP50) sembradas exponiendo placas NGM durante 15 minutos con 222 μW/cm2 (intensidad) de luz UV para garantizar que los compuestos inductores de mitofagia no sean metabolizados por las bacterias. Las placas deben exponerse con 2.000 J/m2.
NOTA: Segundos de exposición necesarios = 2.000/((intensidad en μW/cm2)*100).
- Agregue compuestos de interés a la parte superior de las placas NGM sembradas. Agregue una cantidad equivalente de vehículo compuesto (solvente utilizado para disolver compuesto, como dimetilsulfóxido (DMSO)) a las placas del vehículo como control negativo. Para el control positivo de la inducción de la mitofagia, se utilizó un tóxico mitocondrial, el paraquat (concentración final de 8 mM). Agregue una solución que contenga 10 μL de caldo de paraquat 8 M con 190 μL de ddH2O en la parte superior de la placa de agar para el grupo de tratamiento. Para el grupo de vehículos, agregue una solución que contenga 10 μL de DMSO con 190 μL de ddH2O en la parte superior de la placa de agar.
nota: La solución de trabajo con paraquat puede conservarse durante 1 mes a 4 °C.
- Agite suavemente las placas hasta que el medicamento o el vehículo cubran toda la superficie. Deje que las placas se sequen con las tapas cerradas a temperatura ambiente durante al menos 1 h antes de transferir las lombrices.
nota: Las placas de medicamentos también se pueden preparar agregando medicamentos en el NGM líquido antes de que se solidifique.
- Día 7: Transfiera de 10 a 20 animales transgénicos adultos de 2 días de edad preparados en el paso 2.1.2 a placas que contengan paraquat, compuesto (s) de interés o vehículo (DMSO). Incubar los animales transgénicos a 20 °C durante 2 días.
- Día 9: Preparar almohadillas de agarosa al 2%. A continuación, añada una gota (10 μL) de 20 mM de levamisol en M9 por almohadilla. Inmovilizar a los animales transgénicos para la toma de imágenes, colocándolos en la gota de levamisol M9. Coloque suavemente un cubreobjetos en la parte superior.
- Capture animales transgénicos individuales utilizando una cámara conectada a un microscopio de epifluorescencia. Adquiera imágenes fluorescentes de nematodos transgénicos completos que expresan mtRosella en las células musculares de la pared corporal con un aumento de 10X. Guarde las imágenes recopiladas.
- Procese las imágenes adquiridas con el software ImageJ. Analizar las células musculares de la pared corporal ubicadas en la cabeza del gusano para evitar la autofluorescencia en el tejido intestinal. Mida el valor promedio de la intensidad de píxeles y el área total para cada imagen fluorescente solo de la región de la cabeza de cada animal. Para analizar el área específica de interés:
- Seleccione 'dividir canal' en el menú desplegable 'imagen' y 'color' para convertir imágenes.
- Utilice la herramienta de "selección a mano alzada" para capturar el área fluorescente de interés.
- Seleccione el comando 'medición' en el menú desplegable 'analizar' y realice el análisis de intensidad de píxeles.
- La intensidad de los píxeles debe normalizarse dividiendo la intensidad por el área total analizada. Tras la normalización, calcule la relación entre GFP y DsRed.
- Utilice software de análisis estadístico para realizar la prueba t de Student (comparación entre dos grupos) o ANOVA (comparación entre varios grupos) para el análisis estadístico con p < 0,05 como significativo.
- Evaluación de la mitofagia mediante la colocalización entre DCT-1 y LGG-1
NOTA: DCT-1 es una proteína de la membrana mitocondrial externa que actúa como un receptor de mitofagia en respuesta a condiciones de estrés, similar a sus ortólogos putativos BNIP3 y NIX/BNIP3L en mamíferos. Por lo tanto, el inicio de la mitofagia se evalúa mediante la colocalización entre el receptor de mitofagia DCT-1 y la proteína de membrana autofagosomal LGG-1 (homóloga de la LC3 de mamíferos).
- Día 1: Recoger larvas L4 de animales transgénicos que expresen tanto DCT-1::GFP como DsRed::LGG-1 en células musculares de la pared corporal5 en una placa NGM sembrada con OP50. Coloque un plato de 5 a 10 lombrices / 3,5 cm y use al menos tres platos. Incubar los nematodos a 20 °C.
nota: Los transgenes se encuentran en plásmidos separados y no están integrados en el genoma. Recoja nematodos portadores de marcadores de contransformación rol-6 (su1006) y pmyo-2 GFP. Solo los gusanos transgénicos con ambos marcadores de contransformación expresan tanto DCT-1::GFP como DsRed::LGG-1 en las células musculares de la pared corporal.
- Siga los pasos de 1.1.2 a 1.1.5.
- Tome imágenes de las células musculares de una sola pared corporal utilizando una cámara conectada a un microscopio confocal. Detecte los bordes de las células musculares de toda la pared del cuerpo y tome imágenes de pila z con un aumento de 63x. También se puede utilizar un aumento mayor.
- Abra y procese imágenes adquiridas con el software confocal. El inicio de la mitofagia está indicado por la colocalización del receptor de mitofagia (DCT-1::GFP) en el marcador autofagosomal (DsRed::LGG-1). Mida manualmente los eventos de colocalización en cada pila de células musculares de la pared corporal. Es esencial mantener todos los ajustes del microscopio y de la cámara (lente y lupa, filtros, tiempo de exposición, resolución, intensidad del láser, ganancia, etc.) consistentes a lo largo de los experimentos. Se deben tener en cuenta todos los ajustes.
- Utilice software de análisis estadístico para realizar la prueba t de Student (comparación entre dos grupos) o ANOVA (comparación entre varios grupos) para el análisis estadístico con p < 0,05 como significativo. Para las comparaciones bidireccionales, utilice la prueba t de Student (p < 0,05 se considera significativa). Para comparaciones múltiples se utiliza el análisis de varianza de factor único (ANOVA), corregido por la prueba post hoc de Bonferroni. Recomendamos analizar al menos 50-70 animales o 30-50 células musculares de la pared corporal para cada condición experimental. Repite el experimento al menos tres veces.
