Un inmunoensayo de electroforesis capilar para la detección de biomarcadores de proteínas

Resumen

Fuente: Sage, J. M., et al. Uso del inmunoensayo de electroforesis capilar para buscar posibles biomarcadores de esclerosis lateral amiotrófica en plaquetas humanas.J. Vis. Exp.(2020)

Este video muestra un protocolo de inmunoensayo de electroforesis capilar para detectar un biomarcador de proteínas asociado con la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) a partir de plaquetas de la sangre humana. La confirmación de la presencia de la proteína biomarcador de ELA se logra mediante la separación basada en el tamaño de las proteínas plaquetarias seguida de una detección quimioluminiscente.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Preparación de tampones y reactivos

NOTA: Prepare todas las muestras según las directrices del fabricante. Durante este procedimiento, use equipo de protección personal (batas de laboratorio, guantes y gafas).

1. Prepare el tampón de lavado de citrato combinando 0,941 g de sacarosa (concentración final de 11 mM), 6,4 mL de cloruro de sodio 5 M (NaCl, 128 mM final), 5,4 mL de fosfato monosódico 0,2 M (NaH₂PO₄, 4,3 mM final), 9,4 mL de fosfato disódico 0,2 M (Na₂HPO₄, 7,5 mM final), 0,352 g de citrato sódico (4,8 mM final), y 0,115 g de ácido cítrico (2,4 mM final). Ajuste el volumen total a 250 mL con ddH₂O. Filtre a través de un disco de filtro de 0,45 μm y ajuste el pH a 6,5. Almacenar hasta 1 año a 4 °C. Llevar la solución a temperatura ambiente (RT) antes de usarla.
2. Prepare el tampón de ruptura combinando 250 mM de sacarosa, 1 mM de ácido etilendiaminérgico tetraacético (EDTA) y 10 mM de clorhidrato de Tris (hidroximetil) aminometano (Tris-Cl, pH 7,4) en un volumen final de 100 mL. Almacenar hasta 1 año a 4 °C. Añadir 2 μL de cóctel de inhibidores de la fosfatasa (1:1000 final) y 1 μL de cóctel de inhibidores de la proteasa (1:2000 final) en 2 ml de tampón de ruptura. Mantener en hielo hasta su uso. Deseche el búfer de ruptura no utilizado.

>2. Aislamiento plaquetario

1. Recoja de 8 a 10 mL de sangre humana en un tubo de extracción de sangre con tapa amarilla que contenga una solución de citrato-ácido y dextrosa (ACD) (75 mM de citrato trisódico, 124 mM de dextrosa y 38 mM de ácido cítrico, pH = 7,4; ACD: sangre = 1:9). Mezcle suavemente el contenido del tubo 5x-6x invirtiendo con la mano.
2. Centrifugar los tubos a 200 x g en un rotor de cubo oscilante durante 20 min a RT.
3. Recoja el plasma rico en plaquetas (PRP) (~3-4 mL) en un tubo inferior cónico de 15 mL y deje aproximadamente 0,5 mL de PRP de la capa leucocitaria (fracción de aspecto borroso) para evitar la contaminación. Si se produce alguna contaminación de glóbulos rojos, repita este paso.
4. Centrifugar las muestras de PRP a 1.200 x g durante 15 min en RT.
5. Lavar los pellets de plaquetas (P1) mediante una resuspensión suave en 1 mL de tampón de lavado de citrato y el pellet por centrifugación a 1.200 x g durante 15 min a RT.
6. Guarde el pellet de plaquetas puras. Deseche el sobrenadante.
7. Vuelva a suspender los gránulos de plaquetas en 600 μL del tampón de ruptura que contiene cócteles inhibidores.
8. Sonicar la suspensión plaquetaria con un sonicador. Coloque la muestra en una mini cubeta de hielo. Ajuste el sonicador en el ajuste 3 durante 20 s en modo continuo.
   NOTA: Limpie la sonda con lejía al 10% seguida de agua destilada.
9. Centrifugar las muestras sonicadas a 20.000 x g durante 30 min a 4 °C para eliminar las fracciones membranosas. Alícuotas de sobrenadantes en 60 μL y almacenar a -80 °C. Evite repetir los ciclos de descongelación/congelación de las fracciones citosólicas plaquetarias.

>3. Preparación para el inmunoensayo de electroforesis capilar (CEI)

NOTA: Se combinaron 100 μL de lisado de plaquetas humanas de pacientes con ELA (n = 8-10), y los sujetos sanos (n = 8-10) se agruparon por separado y se utilizaron para la optimización del ensayo.

1. Rellene las plantillas generadas internamente para el diseño del CEI (Tabla 1) y la preparación de la muestra (Tabla 2). La tabla de preparación de la mezcla de muestra es dinámica y calculará automáticamente cuánto volumen debe eliminarse de la fuente.
   NOTA: Cuando se ingresa el volumen de fuente requerido en la Tabla dinámica 2, se calculará automáticamente el volumen del búfer de muestra de 0.1 X.
2. Etiquete previamente 25 tubos de PCR de 0,2 ml con capilares #1–#25 y colóquelos en una gradilla de PCR. Colocado sobre hielo.
3. Tubos de microcentrífuga de 0,6 mL: uno para cada anticuerpo primario y dilución (si es necesario) que se va a utilizar, uno para el tampón de muestra 0,1x, uno para el luminol-S/peróxido y uno para cada muestra que se va a diluir (si es necesario). Colóquelos sobre hielo en una rejilla para tubos.
4. Extraiga el tampón de muestra, el tampón de lavado, una placa y un cartucho provistos en el módulo de separación del kit maestro de separación CEI de 12 a 230 kDa.
5. Del refrigerador a 4 °C, saque el tampón de dilución de anticuerpos, los anticuerpos primarios, los anticuerpos secundarios, el luminol, el peróxido de hidrógeno y el paquete estándar. Coloque todos los reactivos en hielo, excepto el paquete estándar, que permanece en RT.
   NOTA: Los reactivos de los envases estándar están liofilizados y sellados con una cubierta de aluminio. Para reducir la pérdida de producto, estos deben girarse brevemente con una mini centrífuga antes de abrirlos. Para abrir, los tubos de reactivo pueden perforarse con la punta de una pipeta o retirarse desde la esquina.
6. Para preparar los 400 mM de ditiotreitol (DTT), se añaden 40 μL de agua desionizada al tubo transparente que contiene el DTT.
7. Para preparar 40 μL de mezcla maestra fluorescente 5x, agregue 20 μL del tampón de muestra 10x y 20 μL de la solución DTT preparada de 400 mM al tubo rosa provisto en el kit.
8. Para preparar la escalera biotinilada, agregue 16 μL de agua desionizada, 2 μL de tampón de muestra 10x y 2 μL de la solución DTT preparada de 400 mM al tubo blanco provisto en el kit. Mezcle suavemente y transfiéralo a un tubo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de 0,2 ml para desnaturalizar.
9. Prepare un tampón de muestra 0,1x añadiendo 1,5 μL de tampón de muestra 10x y 148,5 μL de agua desionizada a un tubo de microcentrífuga de 0,6 mL. Vórtice para mezclar y colocar en hielo.
10. Prepare las diluciones de anticuerpos deseadas. Agregue diluyente de anticuerpos en los volúmenes designados para cada tubo de microcentrífuga premarcado. Si los volúmenes son idénticos, utilice la técnica de pipeteo inverso; De lo contrario, enjuague previamente la punta de la pipeta antes de dispensar.
    NOTA: En este ensayo se utilizaron el anticuerpo A-TDP-43 pan y el anticuerpo a-p(S409/410-2) TDP-43. El anticuerpo anti-ERK se utilizó para el control interno y garantizar que los componentes del ensayo funcionaran.
11. Realice el pipeteo inverso para la dilución de anticuerpos como se describe a continuación. Alternativamente, se puede encontrar información adicional en la literatura.
    NOTA: Se prefiere el pipeteo inverso cuando se dispensan pequeños volúmenes secuenciales de soluciones. Esta técnica ofrece algunas ventajas: (i) proporciona un volumen preciso, (ii) elimina la formación de espuma del reactivo en el orificio de la punta y (iii) es ideal para reactivos de pequeño volumen (<5 μL), soluciones viscosas, soluciones de surfactante y soluciones con alta presión de vapor.
    1. Coloque una punta adecuada en una pipeta y presione el émbolo hasta el segundo tope (Paso 2). Sumerja la punta de la pipeta unos milímetros en la solución. Suelte lentamente el émbolo para llenar la punta de la pipeta con la solución mientras la punta aún está sumergida. Retire la punta de la solución y toque suavemente el borde del depósito de reactivo para eliminar el exceso de líquido que queda en el exterior de la punta.
    2. Dispense la solución presionando el émbolo hasta el primer tope (Paso 1). No dispense la solución restante en la punta.
    3. Vacíe la solución restante en la punta hasta el depósito de reactivo presionando el émbolo hasta el segundo tope (Paso 2). Suelte el émbolo a la posición de listo para el siguiente paso de pipeteo.
    4. Agregue el anticuerpo requerido en los volúmenes designados para cada tubo de microcentrífuga premarcado (Tabla 1). No enjuague previamente la punta de la pipeta: agréguela directamente al diluyente y enjuague la punta varias veces para eliminar el anticuerpo. Coloque los tubos sobre hielo.
12. Para preparar la mezcla de muestra de CEI, realice los pasos que se enumeran a continuación para los tubos de PCR etiquetados como tapón # 2 a tapón # 25: Esto es en el mismo orden que en la Tabla 1.
    1. Abra todos los tubos, añada 1,6 μL de tampón de muestra fluorescente 5x a cada tubo mediante una técnica de pipeteo inverso y, a continuación, cierre cada tubo de PCR tras la adición del tampón 5x para minimizar la pérdida de muestra.
    2. Abra todos los tubos, agregue 0.1x tampón de muestra en los volúmenes designados en la Tabla 2 a cada tubo y luego ciérrelo inmediatamente después. Si los volúmenes son idénticos, utilice una técnica de pipeteo inverso. De lo contrario, enjuague previamente la punta de la pipeta antes de dispensar un tampón de muestra 0,1x.
    3. Abra todos los tubos, agregue la muestra de proteína en los volúmenes designados en la Tabla 2 a cada tubo, luego ciérrelos inmediatamente después. Si los volúmenes son idénticos, utilice la técnica de pipeteo inverso. De lo contrario, enjuague previamente la punta de la pipeta antes de dispensar un tampón de muestra 0,1x.
    4. Centrifugar brevemente todos los tubos de PCR en una centrífuga de sobremesa (13.000 x g durante 30 s), frotar los tubos de PCR en vórtice para mezclar y, a continuación, repetir la centrifugación.
    5. Transfiera todos los tubos de PCR a un termociclador con tapa calentada. Desnaturalice las muestras a una temperatura y duración definidas (es decir, 95 °C durante 5 min; 70 °C durante 10 min).
       NOTA: La temperatura y la duración de la desnaturalización deben optimizarse para la proteína objetivo.
    6. Repita el paso 3.12.4.
    7. Regrese todos los tubos de PCR a la gradilla de tubos y colóquelos en hielo.
    8. Durante la etapa de desnaturalización, prepare la solución de revelado (luminol-S: solución de peróxido 1:1), luego agregue 200 μL de luminol-S y 200 μL de peróxido. Colocar sobre hielo.
    9. Para cargar una placa precargada CEI con la muestra preparada anteriormente, dispense los reactivos y las muestras en la placa de ensayo que se muestra en el diseño del ensayo (Figura 1). Evite introducir burbujas de aire.
       NOTA: Si los volúmenes y la solución son idénticos, utilice una técnica de pipeteo inverso. De lo contrario, enjuague previamente la punta de la pipeta antes de dispensar y no expulse el resto al pocillo de la placa utilizando el segundo tope de lengüeta de la pipeta. Un módulo de separación de 12 a 230 kDa puede contener una guía de carga de placas codificada por colores. Coloque esta guía debajo de la placa mientras agrega reactivos y muestras al pocillo, lo que ayuda visualmente al cargar la muestra. La guía de carga de placas también se puede descargar desde el sitio web de la empresa.
       1. añadir 15 μL de mezcla de luminol: peróxido a cada pocillo de la fila E.
          NOTA: Lo ideal es preparar este reactivo justo antes de usarlo y añadirlo a cada pocillo. Si esto es inconveniente, esta mezcla puede prepararse no más de 30 minutos antes de la carga de la placa.
       2. En la fila D, al pocillo D1, añadir 10 μL de estreptavidina-HRP.
       3. En la fila D, a los pocillos D2–D25, agregue 10 μL de anticuerpo secundario designado.
       4. En la fila B, agregue 10 μL de diluyente de anticuerpos a cada pocillo.
       5. En la fila C, al pocillo C1, añadir 10 μL de diluyente de anticuerpos.
       6. En la fila C, a los pocillos C2 a C25, agregue 10 μL de anticuerpo primario designado.
       7. En la fila A, al pocillo A1, agregue 5 μL de escalera biotinilada del tubo de PCR #1.
       8. En la fila A, a los pocillos A2 a A25, agregue 3 μL de la muestra, los tubos de PCR # 2 a # 25 en los pocillos correspondientes # 2 a # 25.
       9. Agregue 500 μL de tampón de lavado a cada pocillo de tampón de lavado designado.
       10. Centrifugar la placa durante 5 min a 1.000 x g a RT.

Tabla 1: Plantilla de carga de la placa de ensayo CEI.

Tabla 2: Plantilla interactiva de preparación de mezclas de muestra. Después de ingresar la concentración de proteína de stock de muestras desconocidas, las celdas interactivas calcularán automáticamente cuánto volumen se debe usar para preparar la mezcla de muestras.

Resultados

Figura 1: Diseño del ensayo.Tanto el anticuerpo primario como la optimización de la muestra de proteína diana se pueden realizar en un solo ensayo. Los capilares 2-7, 8-13, 14-19 y 20-24 representan varias concentraciones de proteínas y rangos primarios de anticuerpos. El capilar 25 representa el control positivo. Se utilizó anticuerpo anti-ERK; sin embargo, se puede incluir cualquier control positiv...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de separación 12-230 kDa	ProteínaSimple	SM-W004	Contiene placa de ensayo precargada y cartucho capilar de 25 canales
Termociclador de 3000 g	Techne	FTC3G/02	Utilizamos este termociclador para calentar la mezcla de muestra
Kit de detección anti-ratón	ProteínaSimple	042-205	Incluye anticuerpo secundario conjugado con HRP, tampón, reactivo de luminol, marcador de peso molecular
Anticuerpo anti-P(S409-410) TDP-43	Tecnología Proteica	22309-1-AP	Anticuerpo primario que reconoce TDP-43 fosforilado
Anticuerpo anti-P(S409-412) TDP-43	CosmoBio-Estados Unidos	CONSEJO-PTD-P02	Anticuerpo primario que reconoce TDP-43 fosforilado
Kit de detección anti-conejo	ProteínaSimple	DM-001	Incluye anticuerpo secundario conjugado con HRP, tampón, reactivo de luminol, marcador de peso molecular
Anticuerpo anti-TDP-43 (pan)	Tecnología Proteica	10782-2-AP	Anticuerpo primario que reconoce la proteína TDP-43 completa
Desmembrador sónico; Modelo100	Fisher Científico		Sonicador. Se utiliza para romper la membrana celular. Este modelo está descatalogado (Modelo XL2000-350)
Centrífuga de sobremesa	Eppendorf	22625004	Modelo# 5810 con cucharón de placa oscilante
Analizador Wes	ProteínaSimple	55892-WS-2203	Realiza la electroforesis en gel capilar
Brújula para SimpleWestern (SW)	ProteínaSimple	Ver.4.0.0.	Compass for SW es la aplicación de control y análisis de datos para instrumentos SimpleWestern