Un inmunoensayo basado en nanopartículas magnéticas que utiliza un dispositivo microfluídico

1. Preparación del dispositivo

1. Llene los canales con agua destilada con una jeringa. Asegúrese de que no haya fugas ni resistencia al flujo. Sumerja el dispositivo en un baño ultrasónico durante 10 minutos para eliminar cualquier resto de acrílico, adhesivo o material no deseado dentro de los canales.
2. Vacíe el agua dentro de los canales del dispositivo. Utilice una jeringa para introducir una solución bloqueante preparada con albúmina sérica bovina (BSA) al 5% (p/v) diluida en 1x solución salina tamponada con Tris (TBS) y previamente filtrada a través de un filtro de jeringa de polietersulfona (PES) de 0,2 μm.
3. Prepare una suspensión de micropartículas de hierro de 7,5 μm de diámetro en 5% BSA.
   nota: Las micropartículas se funcionalizan previamente con una capa de sílice-polietilenglicol (PEG) que confiere resistencia a la absorción de proteínas.
4. Incubar el chip y la suspensión de micropartículas con la solución de bloqueo durante al menos 1 h a temperatura ambiente. Si es posible, permita el bloqueo durante la noche a 4 °C.

>2. Formación de trampas de micropartículas

1. Inserte las micropartículas en el chip con una aguja de jeringa a través de la manguera de salida del canal lateral. Coloque el chip verticalmente y permita que las micropartículas fluyan bajo el efecto de la gravedad a través del canal lateral. Gire el chip 180° en dos pasos de 90° y permita que las micropartículas se dirijan y se compacten con la restricción de 5 μm.
2. Elimine el exceso de micropartículas por gravedad girando 45° hacia el canal lateral.
3. Mantenga el dispositivo en posición vertical para evitar deshacer la trampa de micropartículas. Consulte la Figura 1B para obtener un resumen del proceso de formación de trampas de micropartículas.

3. Inmunoensayo

1. Preparación de nanopartículas
   1. Tomar 2 μL de la suspensión de nanopartículas de 100 nm previamente conjugadas con lisozima (modelo de antígeno). Añádalo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con 100 μl de solución de bloqueo. Incubar durante la noche a 4 °C.
   2. Añadir 150 μL de tampón de lavado (1x TBS, 0,05% Tween 20).
   3. Coloque el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL en un separador magnético. Mantener durante 15 min para permitir la separación de las nanopartículas (Figura 2).
      nota: El volumen mínimo para el separador magnético es de 200 μL. Evite utilizar un volumen menor.
   4. Retire el líquido del tubo con una micropipeta. Evite el contacto con la pared del tubo donde se formó la bolita de nanopartículas.
   5. Añadir 250 μL de tampón de lavado fresco. Mantenga el tubo bajo agitación durante 15 min.
   6. Repita los pasos 3.1.3.-3.1.5. 2 veces más, agitando solo durante 5 min.
   7. Añada la concentración deseada de anticuerpo primario antilisozima (consulte la Tabla de materiales). Ajustar a un volumen final de 100 μL en diluyente de anticuerpos (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
   8. Incubar durante 15 min a 37 °C. Seguir agitando durante 15 min más a temperatura ambiente.
   9. Repita los pasos de lavado 3.1.2.-3.1.6.
   10. Añadir 100 μL de diluyente de anticuerpos. Agregue el anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rábano picante (HRP-AbII) (consulte la Tabla de materiales) a una dilución de 1:500.
   11. Repita los pasos de lavado 3.1.2.-3.1.6.
   12. Mantener las nanopartículas en un volumen final de 50 μL de diluyente de anticuerpos.

4. Montaje experimental

1. Llene las dos jeringas de vidrio de 100 μL con agua, conecte una manguera de 6,5 cm de largo a cada jeringa, inserte un pin de metal en el extremo de la manguera y coloque ambas jeringas en la bomba de jeringa controlada por computadora.
2. Selle todas las mangueras del dispositivo acrílico con calor.
3. Corte la manguera de entrada y conserve solo unos milímetros. Llene la aguja dosificadora con tampón de lavado e insértela en la manguera cortada. Deje que la solución gotee antes de conectar la aguja al dispositivo para evitar el acceso de aire al dispositivo.
4. Corte la manguera de salida del canal lateral. Conéctelo a la bomba de jeringa. A continuación, realice el mismo procedimiento para la manguera de salida del canal principal.
   nota: Es clave realizar los pasos 4.3.-4.4. en este orden para evitar desempaquetar la trampa de micropartículas. Si es posible, verifique el estado de la trampa durante estos pasos con la ayuda de una lupa.
5. Coloque un portaobjetos de vidrio en la platina del microscopio. Fije el imán a la corredera con cinta adhesiva de doble cara y coloque un pequeño trozo de cinta adhesiva a cada lado para fijar los bordes de la viruta al vidrio.
6. Establezca un caudal de 50 μL/h a través de las pestañas Caudal y Unidades en el controlador de la bomba de jeringa. Seleccione el modo de retirada y haga clic en el botón Inicio para activar el flujo del tampón de lavado.
7. Con cuidado, acerque el dispositivo hacia la corredera con el imán de manera horizontal para que el área del chip que contiene la trampa toque con el imán.
8. Pegue los bordes del dispositivo al vidrio con cinta adhesiva de doble cara para evitar que se mueva. Evite obstruir la ruta óptica para la microscopía (Figura 1C).

>5. Inmunodetección

1. Mantenga el tampón de lavado fluyendo durante 10 minutos a 50 μL/h para eliminar el exceso de BSA.
2. Retire el tampón de lavado restante de la aguja dosificadora con una micropipeta. Añadir 50 μL de la suspensión de nanopartículas.
3. Hacer fluir la suspensión de nanopartículas durante 7 min a un caudal de 100 μL/h. A continuación, cambie el caudal a 50 μL/h y fluya durante otros 15 min.
4. Cambie la aguja dispensadora. Fluya el tampón de lavado durante 10 min a 50 μL/h. Prepare el sustrato fluorogénico de acuerdo con las especificaciones del fabricante durante la etapa de lavado.
5. Retire el tampón de lavado restante de la aguja dosificadora con una micropipeta. Añadir 100 μL del sustrato fluorogénico (ver Tabla de Materiales). Fluir el sustrato fluorogénico durante 6 min a 50 μL/h.
6. Ajuste los parámetros de medición de caudal (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h y 10 μL/h) y tiempo (6 min) en las pestañas correspondientes Caudal y Ajuste de temporizador de la interfaz que controla la bomba de jeringa. Asegúrese de seleccionar el modo de retirada para cada una de las mediciones que se van a realizar.
7. Establezca una pestaña adicional de caudal en 50 μL/h y configure el temporizador en 3 minutos para el paso de lavado.
8. Encienda la fluorescencia del microscopio 15 s antes de que se detenga el sustrato a 50 μL/h. Inicie la captura de imágenes con el software de la cámara microscópica 10 s antes de que el sustrato se detenga con un tiempo de exposición de 1.000 milisegundos. Realice imágenes durante 6 minutos a 1 fotograma/s (FPS).
9. Haga clic en el botón Inicio del parámetro de caudal deseado inmediatamente después de que se detenga el caudal de lavado del sustrato a 50 μL/h. Haga clic en el botón Inicio del caudal de lavado (50 μL/h) inmediatamente después de que se detenga el caudal de medición seleccionado.
10. Detenga la captura de imágenes y apague la fluorescencia del microscopio para evitar el fotoblanqueo del sustrato.
11. Repita los pasos 5.8.-5.10. para cada caudal de medición utilizado.

Figura 1: Configuración final del dispositivo. (A) Dispositivo acrílico con las mangueras conectadas a las entradas y salidas correspondientes. La escala muestra las dimensiones del dispositivo en centímetros. (B) Protocolo para la formación de la trampa de micropartículas. Las micropartículas fluyen a través del canal por gravedad cuando el dispositivo se coloca en posición vertical. Las micropartículas se concentran en la restricción de 5 μm. El exceso de micropartículas se elimina fácilmente girando el chip a través del canal lateral. El chip se mantiene vertical para preservar la trampa antes del inmunoensayo. (C) Dispositivo microfluídico montado en un portaobjetos de vidrio que contiene el imán, en la platina del microscopio de fluorescencia invertida. Se observa la aguja dosificadora a través de la cual se añaden los reactivos, así como las mangueras de salida que se conectan a una bomba de jeringa.

Figura 2: Separación de nanopartículas. Utilizando un separador magnético comercial, se pueden concentrar fácilmente nanopartículas de 100 nm para realizar los pasos de lavado durante el inmunoensayo. El pellet formado después de 15 minutos se observa en el círculo rojo.