Una tecnología de chip a presión para un inmunoensayo sándwich multiplexado sin reactividad cruzada

Resumen

Fuente: Li, H. et al., Snap Chip para inmunoensayos sándwich multiplexados sin reactividad cruzada y sin observadores.J. Vis. Exp. (2017)

El video muestra la implementación de la tecnología de chip instantáneo para inmunoensayos sándwich multiplexados sin reactividad cruzada. La simple acción de encajar dos portaobjetos de microarrays, cada uno de los cuales contiene diferentes reactivos, garantiza la transferencia de reactivos sin contaminación cruzada y ayuda a detectar múltiples proteínas mediante inmunoensayo sándwich.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Fabricación y almacenamiento de chips de presión

1. Método de transferencia única (Figura 1a)
   1. Soluciones puntuales de cAb que contienen 400 μg/mL de anticuerpos y 20% de glicerol en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un portaobjetos de ensayo de nitrocelulosa (o vidrio funcionalizado) con un observador de microarrays de inyección de tinta a una humedad relativa del 60% (1,2 nL para cada punto) con un espaciado de centro a centro de 800 μm. Asegúrese de que la corredera esté fijada en la plataforma de observación de acuerdo con una esquina (aquí, se usó la esquina inferior izquierda).
   2. Incubar el portaobjetos de ensayo manchado a temperatura ambiente durante 1 h con una humedad relativa del 60%.
   3. Sujete una junta del módulo deslizante con 16 compartimentos en el portaobjetos del ensayo para dividirlo en 16 pocillos. Enjuague el portaobjetos tres veces añadiendo 80 μL de PBS que contenga 0,1% de Tween-20 (PBST) en cada pocillo, y agitando a 450 rpm en un agitador, 5 min cada vez.
   4. Añadir 80 μL de soluciones de bloqueo a cada pocillo y agitar durante 1 h a 450 rpm.
   5. Retire la junta y seque el portaobjetos del ensayo con un chorro de nitrógeno.
   6. Fije una corredera de transferencia en el mazo de observadores y empuje la esquina inferior izquierda de la corredera contra la esquina inferior izquierda del mazo de observadores. La inyección de tinta detecta una serie de marcas de alineación (una solución de microesferas de poliestireno) con el mismo diseño que el de los anticuerpos de captura (cAbs).
   7. Deje que las marcas de alineación se sequen. Dale la vuelta a la corredera de transferencia y vuelve a colocarla en la plataforma de observación, fijándola contra la esquina inferior izquierda.
   8. Prepare las soluciones de detección de anticuerpos (dAb) que contienen 20 μg/mL de anticuerpos, 20 % de glicerol y 1 % de albúmina sérica bovina (BSA).
   9. Con la cámara del observador, tome una fotografía de una marca de alineación. Implemente esta imagen en el programa de detección como un fiducial y haga que el sistema de reconocimiento de imágenes del observador de inyección de tinta identifique la marca superior izquierda. Utilice su coordenada como el primer punto de la matriz de dAb. Spot 8 nL por gota con un espaciado de centro a centro de 800 μm.
2. Método de doble transferencia (Figura 1b)
   1. Coloque una diapositiva de transferencia 1 en la plataforma de observación de inyección de tinta contra la esquina inferior izquierda. Localice soluciones de cAbs que contengan 400 μg/mL de anticuerpos, 20% de glicerol y 1% de BSA en PBS en el portaobjetos con un observador de microarrays de inyección de tinta a una humedad relativa del 60% (0,4 nL para cada mancha y ~ 200 μm de diámetro). El espaciado de centro a centro es de 400 μm.
   2. Encaje el portaobjetos de transferencia con un portaobjetos de ensayo recubierto de nitrocelulosa (o un vidrio funcionalizado) utilizando un aparato de ajuste (Figura 2) para transferir las gotas de AcAc al portaobjetos del ensayo.
      1. Gire los seis botones del costado del aparato de presión 90 grados para tirar y bloquear todos los émbolos en la posición abierta. Inserte la corredera de transferencia en el soporte de la corredera en su receptáculo con la esquina recortada hacia el pin pogo fijo. Gire el primer juego de tres botones para liberar los émbolos con el pasador de pogo dorado y asegúrese de que las correderas estén empujadas contra los pasadores de alineación.
      2. Inserte un portaobjetos recubierto de nitrocelulosa en el aparato de presión boca abajo sentado sobre los 4 pines pogo. Gire el segundo juego de tres botones para liberar los émbolos con el pasador plateado y asegúrese de que las correderas estén empujadas contra los pasadores de alineación.
      3. Cierre el aparato de presión colocando la carcasa superior en el soporte de la corredera utilizando los pilares y orificios de alineación para un posicionamiento preciso.
      4. Inserte el aparato de encaje cerrado en su jaula y empuje la lengüeta de cierre completamente hacia abajo para colocar los microarrays cara a cara mientras aplica la presión adecuada. Mantener cerrado durante 1 min.
   3. Separa las diapositivas. Incubar el portaobjetos de ensayo a temperatura ambiente durante 1 h con una humedad relativa del 60%. Lave, bloquee y seque el portaobjetos de ensayo como se describe en los pasos 1.1.3 a 1.1.5.
   4. Coloque otra diapositiva de transferencia en la plataforma de observación de inyección de tinta y empuje contra la esquina inferior izquierda. Soluciones puntuales de dAb que contienen 50 o 100 μg/mL de anticuerpos (ver Tabla 1), 20% de glicerol y 1% de BSA en PBS. Asegúrese de que cada punto sea de 0,8 nL y que el espaciado entre centros entre puntos sea de 400 μm.
   5. Guarde el ensayo y la corredera de transferencia. Selle los portaobjetos de ensayo y de transferencia en una bolsa hermética que contenga desecante y colóquelos en un congelador a -20 °C.

>2. Inmunoensayos multiplexados con chips snap

1. Recupere el portaobjetos de ensayo del congelador. Deje la bolsa sellada durante 30 minutos hasta que el portaobjetos alcance la temperatura ambiente.
2. Prepare soluciones de muestra diluidas en serie de 7 puntos mediante proteínas enriquecidas en PBS que contengan 0.05% de Tween-20.
   nota: En este caso, se utiliza un factor de dilución de 5 veces. Las concentraciones iniciales de cada proteína se enumeran en la Tabla 1.
3. Prepare soluciones de muestra según corresponda. Por ejemplo, diluya el suero humano 4 veces en tampón PBST.
4. Sujete una junta de 16 compartimentos en el portaobjetos de ensayo.
5. Llene una columna de 8 pocillos con las 7 soluciones de dilución de proteínas y una solución tampón de PBST sin proteínas mediante pipeteo. Pipetear las soluciones de muestra en los otros 8 pocillos en el mismo portaobjetos.
   NOTA: Se pueden colocar soluciones de 80 μL en cada pocillo. Se pueden utilizar más portaobjetos para medir muestras adicionales cuando sea necesario.
6. Incubar las muestras en un agitador a 450 rpm, ya sea durante 1 h a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4 °C. Lave el portaobjetos tres veces con PBST en el agitador a 450 rpm, 5 min cada vez. Retire la junta y seque la corredera bajo un chorro de gas nitrógeno.
7. Recupere el portaobjetos de transferencia con dAbs del congelador. Mantenga la bolsa sellada durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, incube el portaobjetos en una cámara cerrada (por ejemplo, una caja de puntas vacía) que contenga un 60% de perlas de estabilización de la humedad durante 20 minutos para la rehidratación.
8. Encaje el portaobjetos de transferencia con el portaobjetos de ensayo utilizando un aparato de ajuste (Figura 2) para transferir las gotas de dAb. Véase la sección 1.2.2 para el funcionamiento del aparato de presión.
9. Separa las diapositivas. Incubar el portaobjetos de ensayo en una cámara cerrada que contenga un 60% de perlas de estabilización de la humedad durante 1 h. Sujete el portaobjetos de ensayo con una junta de 16 compartimentos y enjuague el portaobjetos 4 veces con PBST en un agitador a 450 rpm, 5 min cada vez.
10. Pipetear 80 μL de soluciones que contienen 2,5 μg/mL de fluoróforo de estreptavidina en PBS en cada pocillo. Incubar durante 20 min en un agitador a 450 rpm.
11. Enjuague el portaobjetos 3 veces con PBST y una vez con agua destilada en el agitador a 450 rpm. Retire la junta y seque la corredera con gas nitrógeno.

>3. Escaneo de diapositivas y análisis de datos

1. Escanee el portaobjetos de ensayo con un escáner de microarrays de fluorescencia utilizando el láser de 635 nm.
2. Extraiga la intensidad neta de cada punto utilizando un software de análisis (por ejemplo, el analizador array-pro).
3. Calcule el límite de detección (LOD) de cada proteína utilizando un software estadístico y determine las concentraciones de proteínas en las muestras.
   nota: El LOD se define como la intersección Y de la curva estándar incrementada por tres veces la desviación estándar de tres ensayos independientes.

Tabla 1. Concentraciones de proteínas y LODs en tampón del ensayo 50-plex. El nivel de detalle de CA 15-3 está en U/ml (*).

Nombre de la proteína	Concentración inicial (ng/ml)	LOD (pg/ml)	Nombre de la proteína	Concentración inicial (ng/ml)	LOD (pg/ml)
ANG2	500	1.3 × 104	IL-6b	1	2.1 × 102
BDNF	500	1.0 × 102	IL-5	50	77
CA 15-3*	1	4.9 × 103	IL-4	1000	1.5 × 104
Cea	1000	5.4 × 103	IL-2	50	76
CXCL10/IP-10	50	1.7 × 102	Lep	200	4.0 × 102
Crp	200	44	Mig	500	11 × 102
Eng	1000	6.2 × 102	CCL3/MIP-1α	50	3.3
FEAG	50	1.8 × 102	CCL4/MIP-1β	50	12
EGFR	200	1.9 × 102	MMP-3	500	1.0 × 102
FAS-L	500	4.5 × 102	M-CSF	500	8.2 × 103
FGF	500	1.0 × 103	MMP-9	200	3.1 × 102
G-CSF	500	39	CCL2/MCP-1	50	55
GM-CSF	50	3.8	NCAM-1	500	1.7 × 103
GRO-α	50	3.0 × 102	β-NGF	200	1.4 × 103
HER2	500	3.5 × 103	NT-3	200	5.8 × 102
PDGF-BB	200	73	OPN	500	1.9 × 103
IL-1β	500	7.9 × 102	RBP4	200	1.2 ×102
IL-1ra	200	1.1 × 103	Sparc	1000	4.6 ×104
IL-15	50	8.2 × 102	TNF-α	50	4.4
IL-12	1	30	TNF-RI	50	1.3 × 102
IL-11	500	1.2 × 103	TNF-RII	50	12
IL-10	500	6.1 ×102	FAS/TNFRSF6	200	2.8 ×102
IL-8	50	6.6	uPA	200	24
IL-7	2.5	26	uPAR(CD87)	200	76
IL-6a	1000	84	VEGF	200	6.7 × 102

Resultados

Figura 1. Esquema del procedimiento de ensayo comparando (a) los métodos de transferencia simple y (b) doble.

Figura 2. Esquema que muestra las diferencias entre transferencia simple y doble.(a) la duplicación de los reactivos de transferencia amplific...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Comprimido de solución salina tamponada con fosfato	Fisher Científico	5246501EA
Cy5 conjugada con estreptavidina	Rockland	S000-06
Preadolescente-20	Sigma-Aldrich	pág. 1379
Albúmina sérica bovina	Laboratorios de Investigación Inmunológica de Jackson, Inc	001-000-162
glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
Solución de bloqueo: Estabilizador de microarrays StabilGuard Choice sin BSA	SurModics, Inc	SG02
Portaobjetos recubiertos de nitrocelulosa	Grace Bio-Laboratorios, Inc	305116
Portaobjetos recubiertos de aminosilano	Schott América del Norte	1064875
Dispositivo de ajuste	Parallex BioAssays Inc.	PBA-SD01
Observador de microarrays de inyección de tinta	GeSiM	Nanoplotter 2.0
Junta del módulo deslizante	Grace Bio-Laboratorios, Inc	204862
Perlas de estabilización de la humedad	Parallex BioAssays Inc.	PBA-HU60
Software Array-Pro Analyzer	Cibernética de los medios de comunicación	Versión 4.5
Escáner de microarrays de fluorescencia	Agilent	Escáner de microarrays SureScan
Software de bioestadística	Software GraphPad	Prisma GraphPad 6
Anticuerpo de captura de endoglina	Sistemas de investigación y desarrollo	MAB10972
Proteína endoglina	Sistemas de investigación y desarrollo	1097-ES
Anticuerpo de detección de endoglina	Sistemas de investigación y desarrollo	BAF1097
IL-6a (ver Tabla 1)	Sistemas de investigación y desarrollo
IL-6b (ver Tabla 1)	Invitrogen