Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Tinción con el primer anticuerpo
- Desparafinar y rehidratar portaobjetos fijados en formalina e integrados en parafina (FFPE) con 5 minutos asignados a cada uno de los siguientes pasos: xileno o reactivos equivalentes 3x, 100% etanol 2x, 95% etanol 1x, 70% etanol 1x, 50% etanol 1x y agua destilada 2x.
nota: Los portaobjetos deben permanecer húmedos desde este paso de rehidratación hasta el montaje en el paso final.
- Para la recuperación opcional de antígenos, coloque los portaobjetos en 275 mL de solución de citrato de sodio hirviendo (10 mM, pH = 6,0) durante 8 min. Para mantener la solución hirviendo, coloque los portaobjetos planos en la parte inferior de una caja de puntas de pipeta de14 x 9,5 x 9 cm 3 (ancho x largo x alto) con tapa y cocine la solución en el microondas al 70% de potencia en un horno microondas de 700 W durante 8 minutos. A continuación, retire la caja de puntas de pipeta del horno microondas, abra la tapa y deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente (RT) durante al menos 20 minutos.
- Transfiera los portaobjetos a un frasco Coplin que contenga PBST (solución salina tamponada con fosfato con 0,1% de polisorbato 20/80). Lavar con PBST durante 5 min 3x. Si no pasa inmediatamente al siguiente paso, guarde los portaobjetos en este paso con PBST en un frasco Coplin a RT durante unas horas o a 4 °C durante 1-2 días si no pasa inmediatamente al siguiente paso.
- Para preparar la solución de bloqueo, utilice el suero normal de la especie huésped del anticuerpo secundario como reactivo de bloqueo. También se pueden utilizar otros reactivos bloqueantes comerciales. Si se utiliza suero normal empleado para el estudio presentado en este estudio, agregue 100 μL de suero de burro normal a 4.9 mL de PBST. La solución de bloqueo puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 3 días.
- Para el bloqueo, sacuda el PBST de los portaobjetos y cúbralos rápidamente con suficiente solución de bloqueo. Incubar los portaobjetos en RT en una cámara humidificada durante 30 min.
- Prepare la solución de anticuerpo primario (500 μL para dos portaobjetos) utilizando la solución de bloqueo para diluir el anticuerpo primario a la concentración deseada. La solución debe almacenarse en hielo hasta su uso.
- Para la 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (3βHSD), agregue 2 μL de anticuerpo 3βHSD en 498 μL de solución de bloqueo.
- Para la tirosina hidroxilasa (TH), agregue 0,5 μL de anticuerpo TH en 499 μL de solución bloqueante.
- Para la β-catenina, agregue 1 μL de anticuerpo de β-catenina en 499 μL de solución de bloqueo.
- Para la 20α-hidroxiesteroide deshidrogenasa (20αHSD), agregue 1 μL de anticuerpo 20αHSD en 499 μL de solución de bloqueo.
- Para el citocromo P450 2F2 (CYP2F2), agregue 2 μL de anticuerpo CYP2F2 en 498 μL de solución de bloqueo.
- Incubar con el anticuerpo primario sacudiendo la solución de bloqueo de los portaobjetos y cubriéndolos rápidamente con suficiente solución de anticuerpo primario. Incubar los portaobjetos en una cámara humidificada durante la noche a 4 °C. Durante la incubación, los portaobjetos pueden estar cubiertos por un pequeño trozo de película de parafina para evitar que se sequen.
- A la mañana siguiente, lave los portaobjetos con PBST durante 5 minutos 3 veces.
- Prepare la solución de anticuerpo secundario (500 μL para dos portaobjetos) utilizando la solución de bloqueo para diluir el anticuerpo secundario biotinilado a la concentración deseada (por ejemplo, 1 μL de anticuerpo anti-ratón de burro o anticuerpo anti-conejo de burro en 499 μL de solución de bloqueo). La solución debe almacenarse en hielo hasta su uso.
- Incubar con el segundo anticuerpo sacudiendo el PBST de los portaobjetos y cubriéndolos rápidamente con suficiente solución de anticuerpo secundario. Incubar los portaobjetos en una cámara humidificada durante 1 h a RT.
nota: Si la biotina endógena es una preocupación, use un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa en lugar del anticuerpo secundario biotinilado. Vaya al paso 1.14 si utiliza un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa en el paso 1.10.
- Lave los portaobjetos con PBST durante 5 minutos 3 veces.
- Prepare la solución de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (SA-HRP) (500 μL para dos portaobjetos) agregando 0,5 μL de SA-HRP en 499 μL de PBS. La concentración final es de 1 μg/mL.
- Incubar con la solución SA-HRP. Sacuda el PBST de los portaobjetos y cúbralos rápidamente con suficiente solución SA-HRP. Incubar los portaobjetos en una cámara humidificada durante 0,5 h a RT.
- Lave los portaobjetos con PBST durante 5 minutos 3 veces.
- Prepare la solución de fluoróforo-tiramida diluyendo fluoróforo-tiramida con su tampón de dilución de acuerdo con las instrucciones del fabricante (por ejemplo, 5 μL de fluoróforo-tiramida en 496 μL de tampón de dilución).
- Realice el desarrollo de la señal con fluoróforo-tiramida sacudiendo el PBST de los portaobjetos y cubriendo rápidamente los portaobjetos con suficiente solución de fluoróforo-tiramida. Incubar en una cámara humidificada durante 1 min en RT. El tiempo de incubación se puede ajustar para obtener la intensidad de fluorescencia deseada. Detenga la reacción transfiriendo los portaobjetos a un frasco de Coplin que contenga PBST. Lave los portaobjetos con PBST durante 3 minutos 2 veces.
- Las señales se pueden verificar rápidamente bajo un microscopio de fluorescencia para confirmar el resultado en esta etapa. Si no se utilizan cubreobjetos, aplique una gota de glicerol:PBS (1:1) en cada sección para mantener las muestras húmedas. Lave los portaobjetos con PBST durante 3 minutos 2 veces. Los portaobjetos pueden almacenarse en PBST a 4 °C durante unos días antes de pasar al siguiente paso.
>2. Quitar el primer anticuerpo
- Coloque los portaobjetos en 275 mL de solución de citrato de sodio hirviendo (10 mM, pH = 6,0) durante al menos 8 min. Mantenga la solución hirviendo colocando los portaobjetos planos en el fondo de una caja de puntas de pipeta de 14 x 9,5 x 9 cm3 (ancho x largo x alto) con tapa y calentando la solución en el microondas al 70% de potencia en un horno microondas de 700 W durante 8 minutos. Si se prefiere un tiempo de extracción más largo, puede ser necesario rellenar el tampón con una solución de citrato de sodio hirviendo para mantener los portaobjetos sumergidos en la solución tampón en todo momento. Retire la caja de puntas de pipeta del horno microondas, abra la tapa y deje que la solución se enfríe a RT durante al menos 20 minutos.
- Transfiera los portaobjetos a un frasco Coplin que contenga PBST. Lavar con PBST durante 5 min 3x. Si el siguiente paso no se realiza inmediatamente, guarde los portaobjetos en un frasco Coplin con PBST a RT durante unas horas o a 4 °C durante 1-2 días.
>3. Tinción con el segundo anticuerpo
- Comience desde el paso de bloqueo y siga los mismos procedimientos en el paso 1.5 hasta el paso 1.14. En las etapas de desarrollo de la señal (paso 1.15 y paso 1.16), utilice el fluoróforo-tiramida en un espectro de fluorescencia diferente.
nota: Los portaobjetos se pueden pelar con este método varias veces para permitir la tinción multiplex. El último anticuerpo no requiere fluoróforo-tiramida como reportero. Se puede utilizar un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos para mostrar las señales del último anticuerpo primario.
- Incubar portaobjetos con 2 μg/mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) o solución de Hoechst durante 1 min en RT si es necesario un contratinción nuclear. A continuación, lave los portaobjetos con PBST durante 3 minutos y 2 veces.
