Imágenes de inmunofluorescencia multiplexadas para analizar subpoblaciones de células T resistentes a la inmunoterapia

Resumen

Fuente: Granier, C., et al. Análisis de inmunofluorescencia multiplexada y cuantificación de células T intratumorales PD-1⁺ Tim-3⁺ CD8⁺. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra una técnica de imagen multiespectral de fluorescencia in situ para analizar diferentes subpoblaciones de células T infiltrantes en el tejido tumoral. La criosección de tejido de un carcinoma de células renales se trata con anticuerpos para marcar las células T CD8+ que expresan receptores inhibidores específicos y exhiben un fenotipo resistente a la inmunoterapia. La sección etiquetada se visualiza utilizando un microscopio multiespectral para identificar las distintas subpoblaciones de células T CD8+.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto

>1. Inmunofluorescencia in situ Tinción de linfocitos infiltrantes de tumores (TILs)

1. Directrices de procedimiento
   1. Realice todos los pasos experimentales a temperatura ambiente.
   2. Para todos los pasos, realice las diluciones con Tris Buffer Saline (TBS; consulte la Tabla de materiales).
   3. Realice el lavado en TBS para todos los pasos, excepto después de la incubación primaria de anticuerpos. Para este último, utilice Tris Buffer Saline Tween20 (TBST, ver Tabla de Materiales). Para la composición y reconstitución del tampón, consulte la Tabla 1.
   4. Use una cámara de humedad para las incubaciones de anticuerpos y un frasco de tinción para lavarse.
   5. No permita que la sección se seque durante el procedimiento.
2. pretratamiento
   1. Descongele el portaobjetos que contiene la muestra de tejido y séquelo cuidadosamente alrededor de la muestra con una toalla de papel. Delimite el área de reacción que contiene el tejido con un bolígrafo de barrera hidrofóbica (ver Tabla de Materiales). Secar durante 2 min.
   2. Fije las muestras en acetona al 100% durante 5 minutos, seque durante 2 minutos y lave con TBS durante 10 minutos.
3. Saturación y bloqueo
   1. Trate previamente los portaobjetos durante 10 minutos con 3 gotas de avidina al 0,1%, golpee y/o deslice el portaobjetos para distribuir la avidina y elimine las burbujas de aire, y luego trate durante 10 minutos con 3 gotas de biotina al 0,01% (consulte la Tabla de materiales), toque y/o deve. Lavar con TBS.
   2. Realiza un bloqueo de receptores Fc. Aplicar 100 μL de un 5% de volumen/volumen de suero normal diluido en TBS. Utilizar suero de la misma especie huésped que el anticuerpo secundario o terciario marcado (ver Tabla de Materiales); Aquí se utilizó suero de burro. Incubar durante 30 min.
   3. Durante la incubación, haga girar brevemente el anti-CD8, programe la proteína de muerte celular 1 (PD-1) y los anticuerpos de inmunoglobulina de células T y proteína 3 que contiene mucina (Tim-3) (Tabla de materiales). Prepare la mezcla de anticuerpos primarios en TBS como se describe en la Tabla 2.
4. Inmunotinción para CD8, PD-1 y Tim-3
   1. Prepara la mezcla primaria de anticuerpos. Consulte la Tabla de Materiales y la Tabla 2 para conocer los anticuerpos utilizados (anti-CD8, PD-1, Tim-3 y sus correspondientes anticuerpos secundarios) y sus concentraciones.
   2. Toque y/o deslice el suero de burro restante (agregado en el paso 1.3.2). Incubar los portaobjetos con 100 μL de la mezcla de anticuerpos primarios no marcados durante 1 h en una cámara humidificada.
   3. Durante la incubación, haga girar brevemente los anticuerpos anti-conejo Cyanine 5, Alexa Fluor 488-anti-cabra y anti-ratón biotinilados y prepare la mezcla de anticuerpos secundarios como se describe en la Tabla 2.
   4. Lave los portaobjetos en TBST durante 5 min. Seque los portaobjetos.
   5. Incubar los portaobjetos con 100 μL de los anticuerpos secundarios durante 30 min en una cámara humidificada.
   6. Prepare la mezcla de anticuerpos terciarios que contengan cianina 3-estreptavidina, como se describe en la Tabla 2.
   7. Lave los portaobjetos en TBS durante 10 min. Seque los portaobjetos.
   8. Incubar los portaobjetos con 100 μL de la mezcla de anticuerpos terciarios durante 30 min.
   9. Lave los portaobjetos en TBS durante 10 min. Seque los portaobjetos.
5. Montaje de celda
   1. Monte los portaobjetos en un medio de montaje que contenga 4',6-Diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato (DAPI) (1,5 μg/mL DAPI) con un cubreobjetos compatible para microscopía de fluorescencia (ver Tabla de Materiales).
      nota: Como control negativo para cada experimento, se utilizó un portaobjetos con anticuerpos emparejados por isotipos a la misma concentración que los anticuerpos correspondientes. Para esta tinción, utilizamos anticuerpos de control IgG1 de ratón, IgG de conejo e IgG negativo de cabra (ver Tabla de materiales). Como control positivo, utilizamos la amígdala hiperplásica humana, que se sabe que es positiva para los marcadores analizados, para cada experimento. En los resultados se describe una tinción típica (Figura 1). La monotinción de CD8, PD-1 y Tim-3 debe realizarse individualmente (una tinción por portaobjetos) con el mismo pretratamiento y sin DAPI. También se debe realizar un portaobjetos en las mismas condiciones experimentales sin ningún anticuerpo y solo un medio de montaje DAPI. Se deben obtener imágenes de un portaobjetos utilizando condiciones experimentales idénticas, sin ningún anticuerpo y sin DAPI.

>2. Análisis de fluorescencia y recuento celular automatizado

1. Adquisición de imágenes con el microscopio automatizado
   1. Cree un protocolo.
      1. Encienda el software del microscopio automatizado y el iluminador de fluorescencia.
      2. En la barra de menú, haga clic en "Archivo", "Crear protocolo", seleccione "DAPI", "FITC" y "TRITC".
      3. Haga clic en "Siguiente", "Sección de tejido" y haga clic en "Siguiente", "Nombre del protocolo". Elija un nombre, por ejemplo, "CD8-PD-1-Tim-3", haga clic en "Siguiente" y "Guardar".
      4. Coloque manualmente una diapositiva en el escenario.
      5. En la barra de menú, haga clic en "configuración" y "configuración". Haga clic en "Establecer inicio Z" en la nueva ventana.
      6. Ajuste el tiempo de exposición con un portaobjetos de control positivo, es decir, un CD8, PD-1 y Tim-3 teñido tres veces con una muestra DAPI.
      7. En la barra de control, haz clic en "establecer exposición".
      8. Ajuste el tiempo de exposición de cada filtro hasta obtener una señal suficiente pero no saturante.
      9. Para imágenes monocromáticas, realice lo siguiente:
      10. Selecciona adquisición y, en "enfoque automático", elige el filtro DAPI.
      11. En el "límite del área de escaneo", mueva el objetivo superior a la esquina superior izquierda de la diapositiva. Haga clic en "Marcar". Haga lo mismo para la esquina inferior derecha.
          nota: Este paso delimita el área de imágenes de baja potencia (imágenes LP) a 4X; Asegúrese de colocar bien la marca para rodear todas las muestras de la serie.
      12. Para imágenes de alta potencia (HP), realice lo siguiente:
      13. En 'Enfoque automático', elige "DAPI".
      14. En la banda "Adquisición", elija "DAPI", "FITC", "Cy3" y "Cy5". Haga clic en "Aceptar". Haga clic en "Archivo" y "Guardar protocolo" en la barra de menú.
   2. Escanea las diapositivas.
      1. Cargue el protocolo haciendo clic en "Archivo" y "Cargar protocolo" en la barra de menú. Haga clic en "Inicio".
      2. Introduzca 'Lab ID' (ubicación de la carpeta para el almacenamiento de imágenes). Introduzca el ID de diapositiva para identificar la diapositiva. Haga clic en "Siguiente".
      3. Haga clic en "Imágenes monocromáticas" (para escanear toda la diapositiva bajo luz de campo claro y adquirir imágenes secuenciales usando un objetivo 4x).
         nota: Esto produce una vista general en escala de grises de la diapositiva.
      4. Haga clic en "Buscar espécimen". Seleccione el área de tejido a escanear a baja resolución (4x): mantenga presionada la tecla 'Ctrl' y haga clic en un campo con el cursor para seleccionar o deseleccionar campos (Figura 2A).
      5. Haga clic en "LP Imaging" (4x imaging) para la adquisición de imágenes fluorescentes Rojo, Azul, Verde de cada campo.
      6. Para la selección de campos HP, mantenga presionada la tecla 'Ctrl' y haga clic en un campo con el cursor para seleccionar o anular la selección de los campos correspondientes al área de tejido que se escaneará a alta resolución (20x). Seleccione 5 campos (Figura 2B).
      7. Haga clic en "HP Imaging" (imágenes 20x) para obtener una adquisición de imágenes multiespectrales de cada campo (Figura 2C).
      8. Haga clic en "Almacenamiento de datos" para almacenar imágenes en la carpeta seleccionada al principio en LabID.
         nota: El proceso se resume e ilustra en la Figura 2. Para cada paso (detección de tejidos, selección de campo), el usuario puede incrementar y entrenar un algoritmo para un proceso de escaneo completamente automatizado.

Tabla 1: Composición del tampón de TBS y TBST. El TBS se utiliza para mezclas y diluciones de anticuerpos. En el caso de los lavados, todos los pasos se realizan con TBS, excepto los lavados que siguen a los anticuerpos primarios, en los que se recomienda el TBST.

	Tbs	Por confirmar
Tris-HCl	0,05 m	0,05 m
NaCl	0,15 m	0,15 m
Preadolescente 20	-	0.05%
pH	7.6	7.6
preparación	1 comprimido en 500 mL H2O

Tabla 2: Composición detallada de la mezcla de anticuerpos para la tinción de inmunofluorescencia CD8-PD-1-Tim-3. Para cada mezcla de anticuerpos primarios, secundarios y terciarios, se da la dilución a realizar en el volumen correspondiente de TBS para un volumen total de 1 mL. Para un portaobjetos, el volumen total de reacción es de 100 μL para un área de tejido de 2 cm².

El volumen del anticuerpo primario			V final = 1 mL
Conejo anti-CD8	Ratón anti-PD-1	Cabra anti-Tim-3	Tbs
1,6 μL	2 μL	30 μL	966,4 μL
El volumen del anticuerpo secundario
Cian 5 anti-conejo	Biotinilado anti-ratón	Alexa Fluor 488 anti-cabra	Tbs
3,3 μL	2 μL	2,5 μL	Artículo 992.2
El volumen del anticuerpo terciario
	Estreptavidina marcada con Cy3		Tbs
	3,3 μL		996.7

Resultados

Figura 1: Inmunotinción de CD8-PD-1-Tim-3 en un tejido amígdalo incluido en parafina. Se seleccionaron secciones de tejido incluidas en parafina en lugar de secciones criopreservadas para la inmunotinción triple. Después del desparafinado y la rehidratación, se aplicó el mismo protocolo de tinción desarrollado anteriormente para las secciones criopreservadas. Los linfocitos T CD8+ se encuentran fuera...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Vectra 3 Imágenes Cuantitativas Automatizadas de Patología	Perkin Elmer	CLS142338
Análisis de celdas inForm 2.1.	Perkin Elmer	CLS135781
Software R	https://www.r-project.org
Bolígrafo delimitador Dakopen	Dako	S2002
Tris Buffer solución salina TBS Comprimidos	Takara, Bio Inc.	TAKT9141Z	pH7.6 100 comprimidos
Tris Buffer Salina Tween 20 TBS(+Tween20)	Takara, Bio Inc.	TAKT9142Z	pH 7.6 100 comprimidos
Sistema de bloqueo de biotina	Dako	X0590	Avidina 0,1% y Biotina 0,01%
Suero de burro normal	Investigación inmunológica de Jackson	017-000-001	5% vol./vol. concentración
Fluoroshield con DAPI	Sigma-aldrich	F6057	Concentración de 1,5 μg/mL
Funda de cristal de punto	Knittel Gläser,	100039	24x60 mm 100 cubreobjetos
Conejo anti-CD8 Clon P17-V	Novus	NBP1-79055	uso a 4 μg/mL
Ratón anti-PD-1 Clon NAT	ABCAM	AB52587	uso a 2 μg/mL
Cabra anti-Tim-3	I+d	AF2365	uso a 3 μg/mL
Conejo anti-PD-L1 Clon SP142	Roche	7309457001	uso a 1 μg/mL
Ratón AF647 etiquetado pan- Clon de queratina C11	Señalización celular	4528	utilizar a 0,5 μg/mL
Cabra anti-humana gal9	I+d	AF2045	uso a 0,3 μg/mL
Cian 5 burro conjugado anti-conejo	Investigación inmunológica de Jackson	711-175-152	uso a 5 μg/mL
IgG biotinilada F(ab'2) anti-ratón para burros	Investigación inmunológica de Jackson	715-066-150	uso a 3 μg/mL
Alexa Fluor488 burro conjugado anti-cabra IgG	ABCAM	AB150133	uso a 5 μg/mL
Estreptavidina marcada con Cy3	Amersham	PA43001	uso a 3 μg/mL
Ratón de control negativo IgG1	Dako	X0931	uso a 2 μg/mL
IgG de suero de cabra	Sigma-aldrich	I5256	uso a 3 μg/mL
IgG de suero de conejo	Sigma-aldrich	I5006	uso a 4 μg/mL