$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Siembra de células e infección de virus
- A las 20-24 horas antes de la infección por el virus, siembre 5 x 104 de células de fibroblastos de pulmón embrionario humano (HEL) u otras células que se examinarán en un portaobjetos escalonado de 4 pocillos de 11 mm en medio de crecimiento (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS)). Incubar las células a 37 °C con 5% de dióxido de carbono (CO2).
nota: Cada pocillo debe tener un 70-80% de confluencia celular en el momento de la infección.
- Al día siguiente, retire el medio de crecimiento e infecte las células con virus en Medium-199 a un rango de 4 a 10 ufp por célula. Incubar las células infectadas por el virus durante 1 h a 37 °C. Siga agitando el portaobjetos durante el período de incubación.
- Después de la incubación de 1 h, retire Medium-199 y complemente con medio de crecimiento.
nota: Los fármacos que interfieren con las diferentes fases de la infección pueden añadirse en este paso o antes de la absorción viral.
- Incubar las células infectadas por el virus a 37 °C con 5% de CO2 durante varios períodos de infección.
>2. Fijación y permeabilización
- En el momento adecuado de la infección, lavar rápidamente las células infectadas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 3 veces y añadir 200 μL de paraformaldehído al 4% recién preparado en PBS. Incube las células con paraformaldehído durante 8-10 minutos a temperatura ambiente para fijar las células en cada pocillo.
- Aspirar paraformaldehído y lavar los pocillos con 200 μL de PBS 3 veces. Aspirar completamente el PBS después del3º lavado.
- Agregue 100 μL de surfactante no iónico al 0,2% a cada pocillo para permeabilizar las células durante 5-10 min.
- Aspirar el tensioactivo no iónico y lavar los pocillos con 200 μL de PBS 3 veces.
>3. Tinción inmunofluorescente
- Aspirar completamente el PBS y añadir 200 μL de tampón bloqueante (1% de albúmina sérica bovina (BSA) y 5% de suero equino en PBS) en cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 1 h o a 4 °C durante la noche.
- Añadir la concentración determinada experimentalmente del anticuerpo primario contra la proteína 0 de la célula infectada (anticuerpo policlonal anti-ICP0 de conejo) en el tampón de bloqueo e incubar el anticuerpo primario a temperatura ambiente durante 2 h o a 4 °C durante la noche.
- Lavar con tampón de bloqueo 3 veces con 10 min de incubación. Añadir Alexa 594-conjugado anticuerpo secundario anti-conejo de cabra (1:400 diluido en tampón de bloqueo) e incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 1 h. A continuación, lave los portaobjetos 3 veces con tampón de bloqueo a intervalos de 10 minutos.
- Finalmente, lave el portaobjetos una vez con PBS para eliminar los residuos de BSA y suero de caballo.
- Agregue una gota de medio de montaje antidecoloración con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para montar la corredera y séllela con un cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.
>4. Imágenes confocales
- Con un microscopio confocal, ajuste la longitud de onda a 590-650 nm para Alexa 594 y 410-520 nm para DAPI. Seleccione el formato de imagen a 1024 x 1024 y el promedio de línea de 8 para adquirir imágenes de alta resolución.
- Analice cada pocillo en el portaobjetos de 4 pocillos bajo un microscopio confocal. Adquiera imágenes de celdas representativas bajo el objetivo 100X, como se muestra en la Figura 1 y la Figura 2.
- Para contar un gran número de celdas, tome imágenes de campos consecutivos bajo el objetivo 40X.
nota: Requiere de 5 a 10 imágenes para acumular más de 200 células infectadas desde cada punto de tiempo de cada infección.
- En cada experimento, tome fotografías con parámetros confocales constantes para todas las muestras que deban compararse.
>5. Análisis de la distribución nuclear frente a la citoplasmática
- Proyecto abierto con el software de aplicación confocal. Seleccione una imagen a partir de la cual las células deban tabularse para la distribución nuclear frente a la citoplasmática de ICP0.
- Haga clic en la pestaña "Cantidad" en el menú superior y seleccione "ordenar ROI" en el menú de herramientas.
- Dibuje una línea longitudinal a través de la celda a analizar seleccionando "Dibujar línea" en el menú superior.
nota: Aparecerá un histograma que muestra la intensidad de fluorescencia a lo largo de la línea tanto para ICP0 como para DAPI. En el histograma, la línea azul representa los píxeles DAPI y marca el límite del núcleo, mientras que la línea roja representa los píxeles ICP0.
- En función de la tinción de fondo, establezca un umbral constante para la intensidad de ICP0 a fin de analizar la distribución subcelular de ICP0 en cada experimento.
- Como se ejemplifica en la Figura 2, si la señal roja está en promedio por debajo del umbral en la región nuclear pero está por encima del umbral más allá del límite azul, clasifique la señal roja como predominantemente ubicada en el citoplasma.
- Si la señal roja está por encima del umbral en todo el núcleo y más allá del límite de la señal azul, agrupe la señal roja como núcleo más localización citoplasmática.
- Si la señal roja está por encima del umbral en el núcleo, pero en promedio está por debajo de él fuera del límite de la señal azul, agrupe la señal roja como localización nuclear.
- Tabular más de 200 células infectadas de cada muestra en diferentes momentos de infección y trazar en un gráfico de barras para ilustrar el movimiento de ICP0 según el tiempo (Figura 3).
