Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Escisión quirúrgica y preparación de tejidos
- Eutanasia del ratón inyectando por vía intraperitoneal 1 mL de tribromoetanol (preparado según el protocolo estándar; Tabla de Materiales).
nota: La asfixia por CO2 debe evitarse en los estudios pulmonares, ya que podría causar lesión pulmonar y alterar las características y propiedades de las células inmunitarias pulmonares. También se debe evitar la luxación cervical, ya que podría causar lesiones mecánicas del pulmón.
- Transfiera el mouse a un área limpia y dedicada para la operación quirúrgica.
- Estabilice el ratón con el lado dorsal hacia abajo usando agujas o cinta adhesiva en las cuatro extremidades. Utilice etanol al 70% para desinfectar la piel de la zona ventral.
- Realiza una incisión en la piel, desde el cuello hasta el abdomen. Retire con cuidado la piel de la zona torácica.
- Retire con cuidado el esternón y las costillas.
- Enjuague los pulmones inyectando 10 ml de solución salina fría tamponada con fosfato (PBS) directamente en el ventrículo derecho, utilizando una aguja de 18-21 G, hasta que los pulmones se vuelvan completamente blancos.
- Retire con cuidado el timo y el corazón sin tocar los pulmones.
- Separe suavemente los pulmones de los tejidos circundantes y transfiéralos a un tubo con tampón de albúmina sérica bovina fría (BSA) (Tabla 1).
nota: Se debe hacer un esfuerzo para eliminar toda la grasa adyacente de los pulmones antes de preparar aún más la suspensión unicelular, ya que esto podría sesgar las lecturas.
2. Preparación de la suspensión unicelular
- Transfiera los pulmones a una placa de Petri vacía y píquelos con dos bisturíes finos. Transfiera todos los pedazos del pulmón picado a un nuevo tubo cónico de 50 mL. Utilice 5 mL de tampón de digestión para lavar la placa y añádala al tubo de 50 mL que contiene el pulmón picado (Tabla 1).
nota: El tampón de digestión debe prepararse inmediatamente antes de su uso. Utilice 5 mg/mL de colagenasa. La combinación de 1 o 5 mg de colagenasa con tampón BSA o PBS sin proteínas no mejoró los resultados (Figura 1).
- Asegure la tapa del tubo y digiera el pulmón durante 30 minutos en un agitador orbital a una velocidad de 150 rpm a 37 °C. Detenga la reacción añadiendo 10 mL de tampón BSA frío.
- Después de la digestión, use una aguja de 18 G para mezclar y disolver los trozos de pulmón. Coloque un filtro de 70 μm en la parte superior de un nuevo tubo cónico de 50 mL.
nota: El uso de un filtro de micras más pequeño podría resultar en la pérdida de las principales poblaciones mieloides.
- Transfiera lentamente la mezcla pulmonar digerida directamente sobre el colador. Use el lado de goma de un émbolo de jeringa de 10 ml para romper las piezas pulmonares restantes en el filtro. Lave el material procesado en el filtro con tampón BSA.
- Centrifugar la suspensión unicelular a 350 × g durante 8 min a 4 °C.
- Deseche cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 ml de tampón de lisis de amonio-cloruro-potasio (ACK). Mezclar bien con una pipeta de 1 mL e incubar durante 90 s a temperatura ambiente.
- Añadir 10 mL de tampón BSA frío para detener la reacción y centrifugar a 350 × g durante 7 min a 4 °C. Deseche con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en el tampón de tinción para contar las células con un hemocitómetro.
- Vuelva a suspender las células a una concentración de 5 × 106 células/ml y utilícelas para la tinción de superficies (ver sección 2)
nota: Para este propósito, coloque las células en una placa de fondo redondo de 96 pocillos, seguida de tinción de anticuerpos y lavados. Si no dispone de una centrífuga de placas, utilice tubos de flujo en lugar de placas. Con este protocolo, se pueden obtener ~15-20 × 106 células por pulmón de un ratón C57BL/6 de 6-10 semanas de edad de tamaño medio.
>3. Tinción de anticuerpos en superficie
- Transfiera 1 × 106 celdas en 200 μL por pocillo en una placa de 96 pocillos. Centrifugar la placa a 350 × g durante 7 min a 4 °C. Mientras tanto, prepare la solución de bloqueo Fc diluyendo el anticuerpo anti-16/32 (1:100) en tampón de tinción (Tabla 1).
- Vuelva a suspender las células en 50 μL de la solución de bloqueo de FC preparada previamente (Tabla de materiales) e incube durante 15-20 min a 4 °C o en hielo.
- Añadir 150 μL de tampón de tinción y centrifugar la placa a 350 × g durante 5 min a 4 °C. Mientras tanto, prepare el cóctel de anticuerpos de superficie diluyendo los anticuerpos de superficie (1:100; Tabla 2) en tampón de tinción.
NOTA: (i) El anticuerpo anti-16/32 para el bloqueo de Fc se puede utilizar con los anticuerpos de superficie en la misma mezcla. (ii) Si se utiliza un colorante de viabilidad fijable, añadirlo al cóctel de anticuerpos de superficie a una dilución de 1:1.000.
- Vuelva a suspender las células en 50 μL del cóctel de anticuerpos de superficie preparado previamente e incube durante 30-40 minutos a 4 °C en la oscuridad. Lave las células con tampón de tinción dos veces.
nota: Si no se requiere tinción intracelular, vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón de tinción y proceda directamente a la adquisición de datos en el citómetro de flujo. Alternativamente, las células pueden fijarse y almacenarse a 4 °C para su posterior adquisición. Recomendamos utilizar las células para la citometría de flujo en un plazo de 24 h.
>4. Fijación celular y tinción intracelular
- Prepare el tampón de fijación/permeabilización (tampón Fix/Permeable) mezclando tres partes de concentrado de fijación/permeabilización y 1 parte de diluyente de fijación/permeabilización del conjunto de tampones de tinción FoxP3/Transcription Factor (Tabla 1).
- Vuelva a suspender las células en 50 μL del tampón Fix/Perm preparado previamente por pocillo de la placa de 96 pocillos, donde se sembraron las células como se describe en la sección 3, e incubarlas durante 20-25 min a 4 °C en la oscuridad.
- Diluya el tampón de permeabilización 10x como 1: 10 en agua desionizada purificada para preparar un tampón de permeabilización 1x.
- Lave las células una vez con 1x tampón de permeabilización. Mientras tanto, prepare el cóctel de anticuerpos intracelulares diluyendo los anticuerpos intracelulares (1:100) en 1 mL de tampón de permeabilización.
- Vuelva a suspender las células utilizando 50 μL del cóctel de anticuerpos de superficie preparado previamente por célula de la placa de 96 pocillos e incube durante 40 minutos a 4 °C en la oscuridad.
- Lave las células una vez con tampón de permeabilización y otra vez con tampón de tinción. Después del lavado final, vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón de tinción.
nota: Si no se dispone de un citómetro de flujo con lector de placas, transfiera las células a tubos de citometría de flujo.
- Adquiera un mínimo de 1,5 × 106 células por muestra en el citómetro de flujo.
nota: Para muestras de control de un solo color y sin teñir, 0,5-1 × 106 células por muestra serán suficientes. Se recomienda valorar los anticuerpos individuales utilizados para lograr una tinción óptima y reducir los costos. El presente protocolo se ha optimizado utilizando el tampón Fix/Perm preparado con el conjunto de tampones de tinción FoxP3. Debido a que CD68 es un marcador citoplasmático y no nuclear, otras soluciones de permeabilización, como una baja concentración de paraformaldehído o kits de citofix/citoperm de varios proveedores, podrían ser suficientes.
Tabla 1: Búferes.
| Búfer BSA | PBS + 0,5% albúmina sérica bovina |
| Tampón de digestión | Tampón BSA precalentado (37 °C) + 5 mg/mL de colagenasa tipo 1 + 0,2 mg/mL de DNasa I |
| Tampón de tinción | PBS + 2.5% FBS |
| Búfer fijo/permanente | Tres partes de diluyente de fijación/permeabilización y 1 parte de diluyente de fijación/permeabilización del set de tampones de tinción Foxp3/Factor de transcripción |
| Tampón de permeabilización | Tampón de permeabilización 10x del juego de tampones de tinción Foxp3/Transcription Factor diluido 10 veces en agua desionizada purificada |
Tabla 2: Uso de anticuerpos monoclonales.
| antígeno | clon | fluorocromo | dilución | Superficie/intracelular |
| CD45 | 30-F11 | APC/CY7 | 1:100 | Superficie |
| GR-1 | RB6-8C5 | BV421 | 1:100 | Superficie |
| CD68 | FA-11 | PerCPCy5.5 | 1:100 | intracelular |
| CD11b | M1/70 | PECy7 | 1:100 | Superficie |
| Siglec F | S17007L | FITC | 1:100 | Superficie |
| CD11c | N418 | BV650 o BV510 | 1:100 | Superficie |
| CD64 | X54-5/7.1 | PE/Deslumbramiento 594 | 1:100 | Superficie |
| MHC-II | M5/114.15.2 | AF700 | 1:100 | Superficie |
| CD103 | 2.00E+07 | PE / FITC | 1:100 | Superficie |
| Kit de manchas de células muertas de lectura lejana reparable vivo/muerto | | FarRed (APC) o Aqua (BV510) | 1:1000 | Superficie |
| CD3 | 17A2 | pei | 1:100 | Superficie |
| B220 | RA3-6B2 | AF488 | 1:100 | Superficie |
| NK1.1 | PK136 | FITC | 1:100 | Superficie |
| CD24 | 30-F1 | pei | 1:100 | Superficie |
| MERTK | 2B10C42 | pei | 1:100 | Superficie |
| F4/80 | BM8 | BV605 | 1:100 | Superficie |
| CX3CR1 | SA011F11 | pei | 1:100 | Superficie |
| FcBlock (CD16/32) | 93 | | 1:100 | Superficie |
