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>1. Preparación de células criptocócicas
- Extienda el organismo de prueba con un asa de inoculación en una placa de agar estéril de levadura-extracto de malta (YM).
- Incubar la placa de agar a 30°C durante 48 h.
- Use un asa de inoculación para recoger 5 colonias individuales y suspenderlas en 5 ml de agua destilada estéril.
- Estandarizar las celdas utilizando un estándar de McFarland para obtener una concentración celular entre 0.5 × 105 y 2.5 × 105 unidades formadoras de colonias (UFC) por mL de medio RPMI-1640.
- Dispense una suspensión celular de 100 μL en pocillos de placas de microtitulación que contengan macrófagos sembrados (consulte la sección a continuación).
>2. Preparación de macrófagos
- Cultive una línea celular de macrófagos murinos, RAW 264.7, en un matraz de tejido que contenga 10 mL de medio RPMI-1640, suplementado con 20 mg/mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 20 U/mL de penicilina y 10% de suero fetal bovino.
- Colocar el matraz en una incubadora de CO2 al 5% a 37°C hasta alcanzar el 80% de confluencia.
- Raspe suavemente las células con un raspador de células.
- Transfiera las celdas suspendidas a un tubo de centrífuga de 15 mL.
- Utilice la tinción de azul de tripano para determinar la viabilidad celular.
nota: Es preferible una puntuación de viabilidad superior al 85%.
- Utilice un hemocitómetro para ajustar la concentración celular de los macrófagos a 1 × 106 células/mL utilizando una solución de 10 mL de medio RPMI-1640 fresco y estéril.
- Dispensar 100 μL de suspensión de células en pocillos de una placa de microtitulación estéril de fondo plano de 96 pocillos.
- Incubar la placa durante la noche en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C.
nota: Antes de su uso, los medios pasados durante la noche deben aspirarse y reemplazarse con 100 μL de medios frescos y estériles del Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640).
>3. Preparación de compuestos
- Disuelva los fotosensibilizadores de prueba y la primaquina (PQ) en agua destilada para preparar una solución madre.
- Diluya aún más el compuesto en medios RPMI-1640.
nota: La cantidad final de agua destilada en los medios RPMI-1640 nunca debe exceder el 1%.
- Dispensar una solución de 100 μL del fotosensibilizador preparado para cuadruplicar la concentración deseada en pocillos apropiados que contengan los macrófagos y las células criptocócicas ya sembrados.
>4. Implementación del tratamiento fotodinámico (PDT)
- Establezca las siguientes condiciones experimentales:
- Células cocultivadas con 0 μM de PQ y expuestas a luz oscura (DL) durante 2 min (es decir, células no tratadas (no Rx))
- Células cocultivadas con 6 μM y expuestas a DL durante 2 min (es decir, efecto del fármaco)
- Células cocultivadas a 15 μM de PQ y expuestas a DL durante 2 min (es decir, efecto del fármaco)
- Células cocultivadas con 30 μM de PQ y expuestas a DL durante 2 min (es decir, efecto del fármaco)
- Células cocultivadas con 0 μM de PQ y expuestas a los rayos ultravioleta (UV) durante 2 min (efecto UV)
- Células cocultivadas con 6 μM de PQ y expuestas a luz ultravioleta (UVL) durante 2 min (es decir, efecto PDT)
- Células cocultivadas con 15 μM de PQ y expuestas a UVL durante 2 min (es decir, efecto PDT)
- Células cocultivadas con 30 μM de PQ y expuestas a UVL durante 2 min (es decir, efecto PDT)
nota: Se debe permitir que las células cocultivadas reaccionen con PQ durante 30 minutos en la oscuridad (cuando corresponda), antes de la exposición a UVL (cuando corresponda).
nota: En el presente trabajo, determinamos que PQ tiene una absorción UV/Vis de 260 nm, que se encuentra en el rango UV de la lámpara germicida. Debido a esto último, utilizamos una lámpara germicida ultravioleta C (UVC) instalada en un gabinete de seguridad biológica de Clase II como fuente de luz para implementar PDT. Se informa que la lámpara tiene una potencia nominal de 30 vatios. Las células se mantuvieron a aproximadamente 20 cm de la lámpara en el estudio actual. A esta distancia, se estima que la lámpara tiene una salida de radiación de 625 μW/cm2.
5. Recuento de colonias para determinar la supervivencia de las células criptocócicas
- Después de iniciar el tratamiento fotodinámico de las células cocultivadas como se indicó anteriormente, incubar las placas a 37 °C con 5 % de CO2 durante 18 h.
- Pasadas las 18 h, aspirar el sobrenadante.
- Lave los pocillos con 200 μL de solución tampón de fosfato (PBS) para lavar las células no internalizadas. Repita este paso tres veces.
- Añadir 300 μL de Triton X-100 al 0,1% a los pocillos e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Aspire el contenido de los pocillos y dispense en tubos de plástico estériles de 1,5 ml.
- Prepare una dilución 1 en 10 de las células con agua destilada.
nota: Ajustar la dilución para que sea posible recuperar entre 30 y 300 colonias en placas de agar.
- Pipetear 50 μL de la dilución en una placa de agar Yeast Malt (YM).
- Utilice un método de placa extendida para crear un césped de confluencia de células en la superficie de la placa de agar.
- Incubar las placas a 30°°C durante 48 h.
- Cuente las unidades formadoras de colonias (UFC) desarrolladas en las placas de agar.