El efecto de la aspirina y el ibuprofeno en la capacidad fagocítica de los macrófagos

Resumen

Este video muestra un método para evaluar el impacto de la aspirina y el ibuprofeno, en sus concentraciones inhibitorias mínimas, sobre la fagocitosis de los macrófagos utilizando células fúngicas teñidas con colorante fluorescente sensibles al pH. Los fármacos inhiben la ciclooxigenasa-2, disminuyendo la formación de prostaglandinas y potenciando la fagocitosis de los macrófagos, como se observó a través de las mediciones de fluorescencia del colorante sensible al pH.

Protocolo

1. Consideraciones de seguridad

1. El personal debe usar equipo de protección personal (EPP).
2. Manipule el patógeno y los macrófagos en una cabina de seguridad biológica de clase II.

>2. Preparación de macrófagos

1. Cultive una línea celular de macrófagos murinos, RAW 264.7, en un matraz de tejido que contenga 10 mL de medio Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), suplementado con 20 mg/mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 20 U/mL de penicilina y 10% de suero fetal bovino (FBS).
2. Coloque el matraz en una incubadora de dióxido de carbono (CO₂) al 5% a 37 °C hasta lograr una confluencia del 80 %.
3. Raspe suavemente las células con un raspador de células.
4. Transfiera las celdas suspendidas a un tubo de centrífuga de 15 mL.
5. Utilice la tinción de azul de tripano para determinar la viabilidad celular.
   nota: Es preferible una puntuación de viabilidad superior al 85%.
   Utilice un hemocitómetro para ajustar la concentración celular de macrófagos a 1 × 10⁵ células/mL utilizando una solución de 10 mL de medio RPMI-1640 fresco y estéril. Dispense 100 μL de suspensión de células en pocillos de una placa de microtitulación estéril de fondo plano de 96 pocillos. Incubar la placa durante la noche en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C.
   nota: Los medios pasados durante la noche deben aspirarse y reemplazarse con 100 μL de medios RPMI-1640 frescos y estériles antes de su uso.

>3. Preparación de células criptocócicas

1. Extienda el organismo de prueba con un asa de inoculación en una placa de agar estéril de levadura-extracto de malta (YM).
2. Incubar la placa de agar a 30°C durante 48 h.
3. Usando un asa de inoculación, inocule un asa de células en 100 mL de caldo de levadura nitrogenado base (YNB) suplementado con glucosa al 4%.
4. Cultive las células (precultivo) durante la noche mientras se agitan a 160 rpm a 30 °C.
5. Al día siguiente, inocular 0,1 mL del precultivo en caldo fresco de YNB (cultivo principal) y dejar que las células crezcan hasta la fase exponencial media (en las mismas condiciones de cultivo).
6. Lave las células dos veces con una solución tampón de fosfato (PBS).
7. Usando un hemocitómetro, estandarice las células a 1 x 10⁵ en PBS.

>4. Tinción de células criptocócicas con la tinción de fagocitosis

1. Dispense 999 μL de las células en un tubo de plástico de 1,5 mL.
2. Añada 1 μL de la tinción de zimosan A verde pHrodo en el mismo tubo.
3. Incubar las células a temperatura ambiente durante 1 h, en la oscuridad, con agitación lenta para reaccionar con la mancha.
4. Al final del período de incubación, lave las células tres veces con PBS.
5. Dispense una suspensión celular de 100 μL a los pocillos que contengan macrófagos sembrados.

5. Preparación de medicamentos

1. Prepare una solución madre de aspirina utilizando 1 mg de aspirina en 1000 mL de etanol absoluto hasta una concentración final de 1000 μg/mL.
2. Diluya aún más el compuesto en el medio RPMI-1640 para alcanzar las concentraciones deseadas del fármaco.
   nota: La cantidad final de etanol en el medio RPMI-1640 nunca debe exceder el 1%. Prepare una solución madre de ibuprofeno utilizando 1 mg de ibuprofeno en 1000 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Diluya aún más el compuesto en el medio RPMI-1640 para alcanzar las concentraciones deseadas del fármaco.
   nota: La cantidad final de DMSO en los medios RPMI-1640 nunca debe exceder el 1%. Prepare una solución de 100 μl de los fármacos preparados al cuádruple de las concentraciones deseadas y dispense en pocillos apropiados que contengan macrófagos sembrados y células criptocócicas.

>6. El efecto de los agentes quimiosensibilizantes sobre la fagocitosis de los macrófagos

1. Incubar las placas con células cocultivadas en presencia de agentes quimiosensibilizantes, aspirina o ibuprofeno en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C durante 2 h o 6 h.
2. Al final del período de incubación, mida la fluorescencia inducida (ej: 492 nm y em: 538 nm).
   nota: La tinción de pHrodo solo emite fluorescencia en ambientes ácidos, como dentro del fagosoma.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
agar-agar	Merck		Se utiliza para preparar platos YM
Extracto de levadura	Merck		Se utiliza para preparar platos YM
Extracto de malta	Merck		Se utiliza para preparar platos YM
peptona	Merck		Se utiliza para preparar platos YM
Base de nitrógeno de levadura (YNB)	Laboratorios Difco		Se utiliza en el cultivo de células criptocócicas
glucosa	Merck		Se utiliza para preparar platos YM
Tinte azul de tripán	Sigma-Aldrich		Para enumerar células vivas y muertas
Solución tampón de fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich		Lavar y diluir las células
RPMI- 1640 medio	Biochrom		Medios de cultivo para macrófagos
Suero fetal bovino (FBS)	Biochrom		Se utiliza para complementar el medio RPMI-1640
Penicilina/Estreptomicina/L-glutamina	Sigma-Aldrich		Añadido al medio RPMI-1640
pHrodo verde zymosan A mancha	Tecnologías de la Vida		Se utiliza para teñir células internalizadas debido a un cambio en el pH
Ácido acetilsalicílico (aspirina)	Sigma-Aldrich		El medicamento que se va a probar
Etanol absoluto	Merk		Se utiliza para disolver la aspirina
ibuprofeno	Sigma-Aldrich		Fármaco que se va a analizar
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Merk		Se utiliza para disolver el ibuprofeno
Placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos	Greiner Bio-One		Se utilizaba como un recipiente dentro del cual se llevaban a cabo las reacciones.
Matraz de pañuelos	Lasec		Se utiliza para cultivar macrófagos
Tubo de centrífuga de 15 mL	Lasec		Se utiliza para contener macrófagos
Raspador de células	Lasec		Se utiliza para separar los macrófagos del matraz de tejido
Asa de inoculación	Lasec		Se utiliza para vetar el cultivo en la placa de agar
Hemotómetro	Marienfield		Para determinar la concentración celular de los macrófagos
Tubos de plástico de 1,5 mL	Merck		Se utilizaba como un recipiente dentro del cual se llevaban a cabo las reacciones.
Espectrofotómetro de investigación EZ Read 800	Biochrom		Para leer la densidad óptica
Fluoroskan Ascent FL	Termo-Científico		Para medir la fluorescencia
Incubadora deCO2	Termo-Fisher		Se utiliza para incubar los macrófagos
Cabina de seguridad biológica de clase II	ESCO		Trabajar de forma segura con los patógenos sin causar daño al usuario.