Un método de inmunofluorescencia para medir la neutralización del citomegalovirus humano

Resumen

Este video muestra un ensayo de inmunofluorescencia diseñado para medir la neutralización del Citomegalovirus Humano (HCMV). Los anticuerpos específicos del virus se mezclan con el virus y se incuban con células de fibroblastos humanos. Los anticuerpos neutralizan el virus, haciéndolo incapaz de infectar las células huésped, mientras que los virus no neutralizados infectan las células. Después de la incubación, el grado de neutralización se determina cuantificando las células infectadas por el virus mediante inmunofluorescencia.

Protocolo

1. Preparación de las células diana para la infección

1. Siembre las células objetivo el día anterior a la realización del experimento en una placa de 96 pocillos (la placa "objetivo").
2. Placa suficientes celdas por pocillo para asegurar una mono>nota: Esto dependerá del tamaño relativo del tipo de célula objetivo. Si utiliza fibroblastos del prepucio humano (HFF), siembre 20.000 células/pocillo.
3. Por lo general, se deben sembrar 21 pocillos (7 de abajo por 3 de ancho) por muestra, lo que permite analizar 4 muestras por placa.
4. Siembre 12 pocillos adicionales por plato (es decir, fila 8) para que sirvan como controles.

>2. Preparación de virus: mezclas de anticuerpos

1. Agregue 90 μL de medio combinado con anticuerpo (y bien mezclado) para crear el doble de la concentración inicial deseada de anticuerpos de prueba en 3 pocillos de la fila 1 de una placa nueva de 96 pocillos (la placa de 'dilución')
   nota: Una concentración inicial típica de anticuerpo sería de 20 μg/mL, pero debe determinarse empíricamente.
2. Agregue 60 μL de medio a cada uno de los 18 pocillos a continuación (es decir, 6 hacia abajo por 3 a lo ancho) de los 3 pocillos del paso 2.1.
3. Agregue 60 μL de medio a 12 pocillos adicionales (es decir, fila 8).
4. Transfiera 30 μL de dilución de anticuerpos de la fila 1 a los pocillos correspondientes de la fila 2.
5. Mezcle el contenido de la fila 2 pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 20 veces con la pipeta multicanal.
6. Transfiera 30 μL de dilución de anticuerpos de la fila 2 a la fila 3.
7. Repita este proceso de mezclar y transferir hasta que se haya mezclado el contenido de la fila 7.
8. Una vez mezclada la fila 7, deseche 30 μL de los pocillos de la fila 7.
9. Diluya el HCMV en un medio completo de modo que 50 μL contengan suficientes partículas infecciosas para provocar una infección por MOI=1 si se añaden directamente a las células.
   nota: El HCMV es un patógeno de categoría de bioseguridad de nivel 2 (BSL-2). Asegúrese de que se implementen los procedimientos de seguridad adecuados y use puntas de filtro para todos los medios expuestos a HCMV.
   nota: Esto requiere el mismo número de partículas infecciosas que células/pozo, que variará según el tipo de célula y el tropismo del virus. Si se utilizan HFF como se ha descrito anteriormente, la concentración de virus requerida es de 4x10⁵ pfu/mL.
   nota: Asegúrese de preparar un exceso suficiente de virus diluido (por ejemplo, un 10% más).
10. Agregue 60 μL de caldo de virus diluido a todos los pocillos que contengan diluciones de anticuerpos y 6 pocillos que contengan solo 60 μL de medio.
11. Agregue 60 μL de medio solo a los 6 pocillos de medio restantes, para que sirvan como controles no infectados.
12. Incubar el virus resultante: mezclas de anticuerpos a 37^oC durante 1 h.

>3. Infección de las células diana

1. Retire todos los medios de las celdas de destino.
2. Con una pipeta multicanal, transfiera 100 μL de mezcla de virus: anticuerpos desde la placa de "dilución" a las células en la posición equivalente en la placa "objetivo".
3. Incubar las células a 37 °C, 5% de CO₂ durante 24 h.

>4. Fijación de células

1. Retire todos los medios de las celdas.
   nota: No es necesario cambiar las puntas entre pozos en este punto.
2. Lave todos los pocillos con 200 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y retírelos.
3. Agregue 180 μL -20 ^oC, etanol 100% a todos los pocillos.
4. Incubar la placa a -20 ^oC durante al menos 30 min.
   nota: Este paso puede extenderse al menos a un mes, siempre que se agregue etanol adicional a medida que comienza a evaporarse.
   nota: A partir de este momento, la placa es segura de manipular en condiciones BSL-1 y se pueden utilizar puntas sin filtro.

>5. Detección de células infectadas viralmente por inmunofluorescencia (IF)

1. Retire el etanol de la placa.
2. Lave todos los pocillos con 200 μL de PBS y retírelos.
3. Agregue 200 μL de PBS a todos los pocillos e incube durante 5 minutos.
   1. Mientras tanto, prepare la dilución primaria de anticuerpos en PBS.
   2. Se requerirán 100 μL de anti-IE monoclonal de ratón 1:2000 por pocillo (tenga en cuenta que la dilución es para el anticuerpo específico enumerado en los materiales)
      NOTA: Es posible que sea necesario optimizar la dilución del anticuerpo utilizado para el FI si se utiliza una alternativa.
   3. Mezcla de vórtice para asegurar una mezcla suficiente.
4. Retire el PBS de todos los pocillos y agregue 100 μL de dilución de anticuerpos primarios.
5. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
6. Eliminar el anticuerpo primario de todos los pocillos.
7. Añadir 200 μL de PBS e incubar durante 5 min.
   1. Mientras tanto, prepare el anticuerpo secundario y la dilución de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en PBS.
   2. Se requerirán 100 μL de IgG anti-ratón conjugada con fluoróforos 1:2000 y 1 μg/mL de DAPI por pocillo.
   3. NOTA: La dilución del anticuerpo secundario utilizado para el FI puede necesitar optimización si se utiliza una alternativa.
   4. Mezcla de vórtice para asegurar una mezcla suficiente.
8. Retire el PBS de todos los pocillos y añada 100 μL de dilución de anticuerpo secundario/DAPI.
9. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 1 h, protegida de la luz.
10. Eliminar el anticuerpo secundario/DAPI de todos los pocillos.
11. Lave todos los pocillos con 200 μL de PBS y retírelos.
12. Agregue 200 μL de PBS a todos los pocillos e incube durante 5 minutos.
13. Retire el PBS y agregue 100 μL de PBS a todos los pocillos y guárdelo, protegido de la luz, a 4 ^oC hasta que esté listo para obtener la imagen><. nota: Las placas se pueden almacenar hasta un mes con una pérdida mínima de calidad de señal/imagen.

>6. Obtención de imágenes y recuento de células infectadas

1. Para cuantificar la infección de manera fácil y precisa, obtenga imágenes de al menos el 25% de cada pocillo, tanto en los canales azul (DAPI, núcleos) como en los canales secundarios de anticuerpos (HCMV proteínas tempranas inmediatas (IE))
   nota: La señal generada por la inmunofluorescencia IE debe ser similar a la de la tinción nuclear y se deben comprobar las imágenes para confirmarlo.
2. Esto se puede realizar manualmente, pero se recomienda el uso de un microscopio automatizado.
   nota: El aumento dependerá de su instrumento, pero a medida que se obtienen imágenes de grandes estructuras (núcleos), los objetivos 4X/10X suelen ser suficientes.
3. Una vez adquiridas las imágenes, procéselas a través del programa de análisis de software de su elección.
   1. Primero, identifique los núcleos a través del canal azul, para calcular el número de células presentes.
   2. Solo estas áreas necesitan ser revisadas para ver si hay señal en el canal rojo, ya que IE es una proteína localizada nuclearmente, para calcular el número de células infectadas.
4. Una vez calculado el número de células infectadas y el número total de células, calcule el porcentaje de infección por pocillo.
5. Estos valores se pueden corregir para los niveles de detección de fondo restando el porcentaje promedio de infección observado en los pozos no infectados de todos los demás pocillos.
   nota: Esto debería estar muy por debajo del 1%. Si es superior al 1%, el procedimiento de análisis requiere optimización.
6. Estos valores corregidos en segundo plano ahora se pueden trazar, interrogar y analizar como se desee.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Clon de anticuerpo monoclonal anti-IE de ratón 6F8.2	Millipore	MAB8131	Anticuerpo primario para la inmunofluorescencia
Rabbit Anti-Mouse IgG, anticuerpo conjugado Alexa fluor 568	Invitrogen	A-11061	Anticuerpo secundario para la inmunofluorescencia
Sistema de imágenes de alto contenido WiScan® Hermes	Idea Bio-médica	-	Microscopio fluorescente automatizado de alto rendimiento para la cuantificación
Software de análisis de imágenes Metamorph	Dispositivos moleculares	-	Software de análisis de imágenes
Control del isotipo IgG1 humano	Merck	M5284	Anticuerpo de control para neutralización
8F9, anticuerpo anti-HCMV glicoproteína B	-	-	Anticuerpo neutralizante contra el HCMV
DAPI	Termo Científico	62248	Tinción de núcleos celulares
DMI4000B Microscopio de fluorescencia invertida	Leica	-	Microscopio fluorescente utilizado para imágenes representativas