Aislamiento y digestión de proteínas neutrófilas

Resumen

Este video muestra el aislamiento de proteínas de los neutrófilos, que luego se procesa y digiere en péptidos más pequeños. Estos péptidos se pueden utilizar para análisis futuros.

Protocolo

1. Recolección y lisis de células de neutrófilos

1. Recoja células HL60 diferenciadas por neutrófilos en un tubo de 15 ml centrifugando muestras a 400 x g durante 5 minutos.
   nota: Los neutrófilos deben estar en una confluencia de 3,5 x 10⁵ células/mL después de la diferenciación. Recolectar aproximadamente cinco millones de células para la extracción total del proteoma.
2. Deseche el sobrenadante y agregue 15 ml de solución tamponada con fosfato (PBS) en el tubo.
3. Centrifugar muestras a 400 x g durante 5 min.
4. Repita los pasos 1.2 a 1.3.
   nota: Las muestras de células pueden congelarse rápidamente con nitrógeno líquido y almacenarse a -80 °C después del paso 1.4, dependiendo del período de tiempo experimental.
5. Añadir 300 μl de clorhidrato de tris (hidroximetil) aminometano (Tris-HCl) frío de 100 mM de pH 8,5 que contenga un comprimido de cóctel inhibidor de la proteinasa (PIC) a cada muestra.
6. Muestras de vórtice brevemente.
7. Agregue 1/10 de volumen de SDS al 20% a una concentración final de SDS al 2%.
8. Para lisar muestras de células, sonda sonique las muestras en un baño de hielo durante 30 segundos y 30 segundos durante cinco ciclos al 10% de potencia.
9. Centrifugar muestras en un centrifugado corto (velocidad máxima durante 5-10 segundos).
   nota: No deje que la célula se deshaga de la pellet. Use un giro corto para recoger el rocío de las paredes del tubo.
10. Transfiera las muestras del tubo de 15 mL a un tubo de 2 mL.
11. Añadir 1/10 de volumen de 1 M de ditiotritol (DTT) a una concentración final de 10 mM de DTT.
12. Muestras de vórtice brevemente.
13. Incubar las muestras durante 10 min agitando a 800 rpm a 95°C.
14. Después de 10 minutos, enfríe las muestras a temperatura ambiente.
    nota: Las muestras se pueden colocar en hielo para acelerar el proceso de enfriamiento.
15. Añadir 1/10 de volumen de 0,55 mM de yodoacetamida (IAA) a una concentración final de 55 mM de IAA.
    nota: Realice el paso 1.15 en la oscuridad para evitar exponer el IAA a la luz.
16. Muestras de vórtice brevemente.
17. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad.
18. Agregue acetona 100% helada a una concentración final del 80% y almacene las muestras a -20 °C durante la noche.
    nota: El almacenamiento a -20 °C se puede realizar durante un máximo de dos semanas si es necesario.

>2. Digestión de proteínas de neutrófilos

1. Centrifugar muestras a 13.500 rpm a 4 °C durante 10 min para precipitar los gránulos de celda.
2. Deseche el sobrenadante y lave los gránulos de celda con 500 μl de acetona helada al 80%.
3. Centrifugar las muestras a 13.500 rpm a 4 °C durante 10 minutos y eliminar el sobrenadante.
4. Repita los pasos 2.1 a 2.3.
5. Pellets de secado al aire.
6. Una vez seco, añadir 100 μl de 8 M de urea/40 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES) al pellet celular y al sonicateto de agua en un baño de agua a 4 °C durante 30 s de forma intermitente, durante 15 ciclos para resolubilizar los pellets de proteína.
7. El uso del ensayo de triptófano de albúmina sérica bovina (BSA) (o equivalente) cuantifica la concentración de proteínas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
8. Añadir 300 μl de bicarbonato de amonio (ABC) para diluir la muestra hasta una concentración final de 2 M de urea.
9. Para digerir 50 μg de proteína, agregue 1:50 de tripsina/LysC (proporción de enzima a proteína) a las muestras en hielo, mezcle las muestras dando golpecitos suaves.
10. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante la noche para realizar la digestión.

Resultados

Figura 1. Flujo de trabajo de células HL60 diferenciadas en neutrófilos para el perfilado proteómico basado en espectrometría de masas. Se cultivaron, recolectaron y procesaron líneas celulares HL60 indiferenciadas y diferenciadas (mediante estimulación química DMSO) para la extracción total del proteoma. Las proteínas se digierieron con tripsina/LysC, y los péptidos se purificaron con C18 STAGE-tips...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo Falcon de 15 ml	VWR	470225-000
25 mL Serológico	Fisher Científico	14955235
Bicarbonato de amonio (ABC)	ThermoFisher Scientific	A643-500
acetona	Sigma Aldrich	34850-1L
Kit de ensayo BSA	VWR	CA62408-940
centrífuga 5810 R	Sigma Aldrich	EP022628188
Ditiotreitol (TDT)	ThermoFisher Scientific	R0861	Preparar 1M de stock de alícuotas de TDT y almacenar a -20°C
Suero fetal bovino (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Descongelar, preparar las alícuotas y almacenar a -20 °C
Bloque calefactor
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Prepare 8 m de urea/40 m de alícuotas HEPES, almacene a -20 °C
Yodoacetamida (IAA)	Fisher Científico	AAA1471514	Prepare 0,55 millones de existencias de alícuotas de IAA y almacene a -20 °C. Evite la exposición a la luz
L-glutamina	Fisher Científico	25030081	Descongelar, preparar las alícuotas y almacenar a -20 °C
nitrógeno líquido
Tubos de microcentrífuga LoBind	Eppendorf	13-698-794
Penicilina Estreptomicina, Anfotericina	Sigma Aldrich	A5955	Descongelar, preparar las alícuotas y almacenar a -20 °C
Células HL60 diferenciadas por neutrófilos
Solución tamponada con fosfato (PBS)	Biotienda	PBS408	Almacenar a temperatura ambiente
Sonicador de sonda	Fisher Científico	Llame al 100-132-894
Comprimido de cóctel inhibidor de proteasa (PIC)	Sigma Aldrich	5892791001	Almacenar a 4°C
RPMI 1640	ThermoFisher Scientific	11875093	Almacenar a 4°C
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	ThermoFisher Scientific	J18220. A1	preparar una solución SDS al 2%
Centrífuga SpeedVac	Eppendorf	07-748-15
Frascos T75	ThermoFisher Scientific	156499
Tris HCL pH 8.5	Fisher Científico	BP152-1	Almacenar a 4°C
Baño ultrasónico	VWR	97043-960
urea	Biotienda	URE001.1