Un procedimiento de punta STAGE para la desalinización y purificación de péptidos

Resumen

Este video muestra la purificación de péptidos a través del procedimiento STAGE Tip. Una columna en miniatura que contiene perlas de resina unidas a largas cadenas de hidrocarburos facilita la purificación basada en la interacción hidrofóbica. Al cargar una muestra de péptido predigerido en la columna, los fragmentos de péptido se unen a las perlas de resina, permitiendo el paso de las impurezas. Se aplica un tampón de elución que interrumpe la interacción hidrofóbica para eluir los fragmentos peptídicos.

Protocolo

>1. Purificación y desalinización de péptidos

1. Empaque tres capas de resina C18 en una punta de pipeta de 200 μl para cada muestra de péptido para construir una punta de extracción STop And Go (STAGE).
2. Añada 1/10 de solución de parada (acetonitrilo al 20% [ACN]] y ácido trifluoroacético al 6% [TFA]) a las muestras.
3. Muestras centrífugas para la precipitación de pellets a 13.200 rpm durante 10 min.
4. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 2 mL y deseche el pellet.
5. Puntas de la etapa de lavado con 100 μl de 100% ACN.
6. Puntas de centrífuga STAGE a 1000 x g durante 2 min.
   nota: Centrifugar las puntas STAGE hasta que todo el líquido haya corrido a través de la resina C18.
7. Lave las puntas STAGE con 50 μl de tampón B (80 % de ACN, 0,5 % de ácido acético y ddH₂O).
8. Puntas de centrífuga STAGE a 1000 x g durante 2 min.
9. Lave las puntas STAGE con 200 μl de tampón A (2 % de ACN, 0,1 % de TFA, 0,5 % de ácido acético y ddH₂O).
10. La etapa de centrífuga se inclina a 1000 x g durante 2 min.
11. Cargue las muestras en las puntas STAGE.
12. Centrifugar muestras a 1000 x g durante 3-5 min.
13. Lave las puntas STAGE con 200 μl de tampón A.
14. Centrifugar a 1000 x g durante 3-5 min.
15. Añadir 50 μl de tampón B en cada punta STAGE
16. Con una jeringa, eluya las muestras que contienen tampón B en un tubo de tira de PCR de 0,2 ml.
17. Una vez eluidas las muestras, seque los péptidos con una centrífuga de vacío durante 45 minutos.
18. Una vez que las muestras estén secas, guárdelas a temperatura ambiente hasta MS.
    nota: Si el almacenamiento de péptidos es necesario durante más de dos semanas, sugerimos almacenarlo a -20 °C.
19. Ejecute la muestra en una espectrometría de masas (MS) de alta resolución.
    nota: Los parámetros de medición de la muestra (p. ej., cantidad de muestra cargada, cromatografía líquida, longitud del gradiente, resolución) dependerán de la instrumentación utilizada.

>2. Perfil proteómico de neutrófilos

1. Procesamiento de datos brutos
   1. Cargue archivos de datos sin procesar obtenidos de MS en MaxQuant.
   2. El software está diseñado para ejecutarse con archivos de adquisición ascendentes y dependientes de los datos, y muchos parámetros predeterminados están optimizados para dichas muestras. Los parámetros predeterminados incluyen la digestión (tripsina P), las modificaciones variables de la oxidación de la metionina (oxidación (M)) y la N-acetilación de proteínas (acetilo (proteína N-term)), y las modificaciones fijas de la carbamidometilación de la cisteína (carbamidometil (C)).
   3. Los ajustes a estos parámetros incluyen la cuantificación sin etiquetas (LFQ; establezca el recuento de proporción mínima en 1), la coincidencia entre ejecuciones (es decir, encendido/apagado) y un número mínimo de péptidos identificados por proteína (se recomienda establecer en 2).
   4. En parámetros globales, importe el archivo FASTA para la identificación de secuencias. Para este experimento se utilizó el archivo FASTA de Homo sapiens (Humano) (UP000005640) de la base de datos Uniprot. nota: Registre la siguiente información para el mantenimiento de registros: ID del organismo = 9606; el número de proteínas = 79.740; Fecha de descarga del archivo.
   5. Establezca el número de núcleos de equipo que se usarán para el procesamiento y seleccione Iniciar.
   6. Al finalizar MaxQuant, se generará una carpeta 'combinada', junto con otros archivos.
      nota: Los otros archivos se pueden usar para identificar péptidos, modificaciones, etc., y pueden ser necesarios para cargar el conjunto de datos completo en repositorios de datos, incluido Proteome Xchange (PRIDE).
2. Análisis y visualización de datos en Perseus
   1. Cargue el 'proteingroups.txt' en Perseus y seleccione todos los archivos de intensidad LFQ para la ventana 'Principal'.
      nota: La información de referencia se importa directamente a las ventanas de Perseus, pero es posible que sea necesario agregar manualmente otra información (por ejemplo, sitios de modificación).
   2. Filtre las filas eliminando los contaminantes, los péptidos inversos y los péptidos identificados solo por el sitio.
   3. Transforme los datos por log₂(x).
   4. Para observar el número de proteínas detectadas en cada réplica, construya un diagrama numérico de Venn.
   5. Establezca anotaciones categoriales para cada muestra.
      nota: A efectos estadísticos, todas las réplicas de una muestra biológica deben tener el mismo nombre.
   6. Filtre las filas en función de los valores válidos, con la proteína identificada en el >50% de las réplicas y dentro de al menos un grupo.
      nota: El filtrado por valores válidos puede ser más estricto, dependiendo de la configuración del experimento y los objetivos (por ejemplo, la proteína debe estar presente en todas las muestras).
   7. Para reemplazar los valores faltantes para LFQ, se puede realizar la imputación de la distribución normal.
      NOTA: los parámetros predeterminados están optimizados para los datos LFQ, pero se pueden ajustar como se desee.
   8. Agregue información de anotación a las filas de proteínas. Agregue el archivo FASTA txt.gz (obtenido del sitio web de Perseus) en las carpetas 'bin', 'conf' y 'annotation' y traiga términos específicos (por ejemplo, nombres de proteínas, nombres de genes, ontología de genes).
   9. La matriz ya está completa y se puede utilizar para pruebas estadísticas (por ejemplo, ANOVA, pruebas t) para determinar cambios significativos en la abundancia de proteínas entre las condiciones probadas. Otras formas de herramientas de visualización incluyen gráficos de análisis de componentes principales, mapas de calor y enriquecimiento de categorías.
      nota: La información de anotación también se puede descargar de UniProt e integrarse en el marco de trabajo de Perseus.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo Falcon de 15 ml	VWR	470225-000
25 mL Serológico	Fisher Científico	14955235
Bicarbonato de amonio (ABC)	ThermoFisher Scientific	A643-500
ácido acético	Sigma Aldrich	1099510001
acetona	Sigma Aldrich	34850-1L
Acetonitrilo (ACN), grado MS	perforar	TS-51101
Kit de ensayo BSA	VWR	CA62408-940
Discos C18 (puntas STAGE)	Fisher Científico	13110019
centrífuga 5810 R	Sigma Aldrich	EP022628188
Ditiotreitol (TDT)	ThermoFisher Scientific	R0861	Preparar 1M de stock de alícuotas de TDT y almacenar a -20°C
Suero fetal bovino (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Descongelar, preparar las alícuotas y almacenar a -20 °C
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Prepare 8 m de urea/40 m de alícuotas HEPES, almacene a -20 °C
Espectrómetro de masas de alta resolución	ThermoFisher Scientific	726042
Yodoacetamida (IAA)	Fisher Científico	AAA1471514	Prepare 0,55 millones de existencias de alícuotas de IAA y almacene a -20 °C. Evite la exposición a la luz
L-glutamina	Fisher Científico	25030081	Descongelar, preparar las alícuotas y almacenar a -20 °C
Tubos de microcentrífuga LoBind	Eppendorf	13-698-794
MaxQuant	https://www.maxquant.org/
Tubos de tiras de PCR	VWR	76318-802
Penicilina Estreptomicina, Anfotericina	Sigma Aldrich	A5955	Descongelar, preparar las alícuotas y almacenar a -20 °C
Perseo	https://www.maxquant.org/Perseus/
solución tamponada con fosfato (PBS)	Biotienda	PBS408	Almacenar a temperatura ambiente
Sonicador de sonda	Fisher Científico	Llame al 100-132-894
Comprimido de cóctel inhibidor de proteasa (PIC)	Sigma Aldrich	5892791001	Almacenar a 4°C
RPMI 1640	ThermoFisher Scientific	11875093	Almacenar a 4°C
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	ThermoFisher Scientific	J18220. A1	preparar una solución SDS al 2%
Centrífuga SpeedVac	Eppendorf	07-748-15
Centrífuga basculante STAGE	Sonación	STC-V2
Frascos T75	ThermoFisher Scientific	156499
Ácido trifluoroacético	ThermoFisher Scientific	85183
Tris HCL pH 8.5	Fisher Científico	BP152-1	Almacenar a 4°C
Tripsina/LysC	Thermo Fisher Scientific	A40009	alícuota y almacenar a -20°C
Baño ultrasónico	VWR	97043-960
urea	Biotienda	URE001.1