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Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Ensayo de neutralización basado en pseudotipos
NOTA: pMN es la inhibición de la transducción mediada por virus de pseudotipo (PV) a través de muestras de suero de convaleciente humano que contienen anticuerpos dirigidos contra la espiga del SARS-CoV-2.
- En una placa blanca de 96 pocillos con la ayuda de una pipeta multicanal, agregue 50 μl de Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco, 10% de suero fetaval bovino (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep) en las filas B a H, columnas 1-12.
- Añada 5 μl de sueros de convalecientes en los pocillos de la fila A, columnas 2-10, con un volumen total de 100 μl de DMEM/10% FBS/1% P/S. Añada una cantidad conocida (p. ej., 5 μl) de antisueros positivos (calibrante NIBSC 20/162, HICC-pool 2 o HICC pool 3) y negativos (sueros de pacientes tomados antes de 2019) en los pocillos A11 y A12 como controles.
- Retire 50 μl de los pocillos de la fila A y realice diluciones en serie dobles en todos los pocillos que se encuentren debajo.
- Con cada paso de dilución, utilice una pipeta multicanal para mezclar de 5 a 10 veces pipeteando hacia arriba y hacia abajo y teniendo cuidado de no producir burbujas de aire.
- Después de completar la dilución en serie, se deben desechar los últimos 50 μl del pocillo final de cada columna.
NOTA: En este punto, cada pocillo debe contener 50 μl de DMEM mezclado y diluciones seriadas de sueros de paciente o sueros de control.
- Placa centrífuga durante 1 min a 500 rpm para garantizar que no quede líquido en las paredes del pozo.
- A partir de los datos obtenidos mediante la valoración de pseudotipos, calcule la cantidad de DMEM necesaria para diluir su PV del SARS-CoV-2 y obtener 5 x 106 RLU en 50 μl, con un volumen total de 5 ml.
- Mezcle esta solución PV diluida en un recipiente de pipetas con la pipeta multicanal y alícuota 50 μl en cada pocillo de la placa, excepto para los pocillos A6-A12 (control solo celda). A1-A6 servirá como control solo PV.
- Placa centrífuga durante 1 min a 500 rpm para garantizar que no quede ningún virus en las paredes del pozo.
- Incubar las placas durante 1 h a 37 °C 5% de dióxido de carbono (CO2), dando tiempo al suero para que se una a la glicoproteína del SARS-CoV-2.
- Prepare una placa de células diana HEK 293T/17 transfectadas 24 h antes con plásmido de expresión de enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y plásmidos de expresión de serina proteasa 2 (TMPRSS2) transmembrana.
- Retire el medio de cultivo de la placa.
- Lave la placa dos veces con 2 ml de PBS en un lado de la placa para evitar el desprendimiento de células y desecharla.
- Agregue 2 ml de tripsina a la placa y coloque la placa en la incubadora hasta que se desprendan las células.
- Después de que las células se hayan desprendido, agregue 6 ml de DMEM/10% FBS/1% de penicilina/estreptomicina a la placa para apagar la actividad de la tripsina y resuspender las células suavemente.
- Cuente las células con el contador de células automatizado TC20TM o con el portaobjetos de la cámara de recuento y añada 1 x 104 células en un volumen total de 50 μl a cada pocillo.
- Incubar la placa durante 48-72 h, a 37 °C, 5% CO2.
- Lea la placa utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Bright GloTM en un luminómetro de microplaca GloMax® Navigator eliminando el medio de cultivo de todos los pocillos y agregando 25 μl de una mezcla 1:1 de reactivo de ensayo de luciferasa PBS: Bright GloTM.
- A partir de los datos brutos proporcionados por el luminómetro, se calculan los títulos de anticuerpos neutralizantes de la concentración inhibitoria máxima media (IC50) utilizando los protocolos establecidos. Los valores de IC50 por debajo de la dilución 1:40 se consideran negativos. Alternativamente, los datos se pueden evaluar utilizando AutoPlate.