Evaluación de anticuerpos neutralizantes funcionales contra el SARS-CoV-2

Resumen

Este video muestra un ensayo de neutralización que mide la eficacia del suero para neutralizar los virus SARS-CoV-2. Involucra virus pseudotipados, dilución en suero y cuantificación basada en luminiscencia, revelando el título de neutralización.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Ensayo de neutralización basado en pseudotipos

NOTA: pMN es la inhibición de la transducción mediada por virus de pseudotipo (PV) a través de muestras de suero de convaleciente humano que contienen anticuerpos dirigidos contra la espiga del SARS-CoV-2.

1. En una placa blanca de 96 pocillos con la ayuda de una pipeta multicanal, agregue 50 μl de Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco, 10% de suero fetaval bovino (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep) en las filas B a H, columnas 1-12.
2. Añada 5 μl de sueros de convalecientes en los pocillos de la fila A, columnas 2-10, con un volumen total de 100 μl de DMEM/10% FBS/1% P/S. Añada una cantidad conocida (p. ej., 5 μl) de antisueros positivos (calibrante NIBSC 20/162, HICC-pool 2 o HICC pool 3) y negativos (sueros de pacientes tomados antes de 2019) en los pocillos A11 y A12 como controles.
3. Retire 50 μl de los pocillos de la fila A y realice diluciones en serie dobles en todos los pocillos que se encuentren debajo.
4. Con cada paso de dilución, utilice una pipeta multicanal para mezclar de 5 a 10 veces pipeteando hacia arriba y hacia abajo y teniendo cuidado de no producir burbujas de aire.
5. Después de completar la dilución en serie, se deben desechar los últimos 50 μl del pocillo final de cada columna.
   NOTA: En este punto, cada pocillo debe contener 50 μl de DMEM mezclado y diluciones seriadas de sueros de paciente o sueros de control.
6. Placa centrífuga durante 1 min a 500 rpm para garantizar que no quede líquido en las paredes del pozo.
7. A partir de los datos obtenidos mediante la valoración de pseudotipos, calcule la cantidad de DMEM necesaria para diluir su PV del SARS-CoV-2 y obtener 5 x 10⁶ RLU en 50 μl, con un volumen total de 5 ml.
8. Mezcle esta solución PV diluida en un recipiente de pipetas con la pipeta multicanal y alícuota 50 μl en cada pocillo de la placa, excepto para los pocillos A6-A12 (control solo celda). A1-A6 servirá como control solo PV.
9. Placa centrífuga durante 1 min a 500 rpm para garantizar que no quede ningún virus en las paredes del pozo.
10. Incubar las placas durante 1 h a 37 °C 5% de dióxido de carbono (CO₂), dando tiempo al suero para que se una a la glicoproteína del SARS-CoV-2.
11. Prepare una placa de células diana HEK 293T/17 transfectadas 24 h antes con plásmido de expresión de enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y plásmidos de expresión de serina proteasa 2 (TMPRSS2) transmembrana.
    1. Retire el medio de cultivo de la placa.
    2. Lave la placa dos veces con 2 ml de PBS en un lado de la placa para evitar el desprendimiento de células y desecharla.
    3. Agregue 2 ml de tripsina a la placa y coloque la placa en la incubadora hasta que se desprendan las células.
    4. Después de que las células se hayan desprendido, agregue 6 ml de DMEM/10% FBS/1% de penicilina/estreptomicina a la placa para apagar la actividad de la tripsina y resuspender las células suavemente.
    5. Cuente las células con el contador de células automatizado TC20^TM o con el portaobjetos de la cámara de recuento y añada 1 x 10⁴ células en un volumen total de 50 μl a cada pocillo.
12. Incubar la placa durante 48-72 h, a 37 °C, 5% CO₂.
13. Lea la placa utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Bright Glo^TM en un luminómetro de microplaca GloMax® Navigator eliminando el medio de cultivo de todos los pocillos y agregando 25 μl de una mezcla 1:1 de reactivo de ensayo de luciferasa PBS: Bright Glo^TM.
14. A partir de los datos brutos proporcionados por el luminómetro, se calculan los títulos de anticuerpos neutralizantes de la concentración inhibitoria máxima media (IC50) utilizando los protocolos establecidos. Los valores de IC50 por debajo de la dilución 1:40 se consideran negativos. Alternativamente, los datos se pueden evaluar utilizando AutoPlate.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Puntas de pipeta MultiGuard Barrier 1-20 μl	Biociencia de Sorenson	30550T
Puntas de pipeta MultiGuard Barrier 1-200 μl	Biociencia de Sorenson	30550T
NuncTM Placa de Cultivo Celular Delta Tratada en Superficie (placas estériles de 10 cm)	Thermo Fisher Scientific	150350
Recipientes de pipeta (50 ml)	genérico
Placa blanca de 96 pocillos	Thermo FisherScientific	136101
Celdas HEK 293T/17	ATCC	CRL-11268
Plásmido de expresión de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) del receptor de entrada de la célula huésped: pCDNA3.1+-ACE2			Simmons 2004
Plásmido de expresión de la serina proteasa transmembrana 2 (TMPRSS2) que ceba la proteína Spike (S) del coronavirus: pCAGGS-TMPRSS2			Bertram 2010
Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/L de glucosa, suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina (P/S)	Pan-Biotecnología	P04-04510 P40-37500 P06-07100
Reactivo de transfección FuGENE® HD, 1 ml	Promega	E2311
Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol	Pan-Biotecnología	P10-040100
Anticuerpo de control positivo (reactivo de investigación para el anti-SARS-CoV-2 Ab) que puede neutralizar el PV del SARS-CoV-2 (NIBSC, código: 20/162, disponible internacionalmente o HICC-pool 2/HICC pool 3)
Plasma de convaleciente humano COVID-19 para analizar
Sistema de ensayo de luciferasa Glo brillante	Promega	E2650