Ensayos para la evaluación cualitativa y cuantitativa de las concentraciones de glucosa en orina de ratón

Resumen

Este video muestra un procedimiento para recolectar orina de ratón y evaluar sus niveles de glucosa. Para evaluar el nivel de glucosa, sumerja una tira reactiva recubierta con enzimas y un tinte cromogénico en la muestra, iniciando un cambio de color que indica los niveles de glucosa. Para cuantificar los niveles de glucosa en orina, introduzca una muestra de orina en una placa de pocillos múltiples con concentraciones de glucosa crecientes, agregue la mezcla de reacción e incube. Mida la absorbancia para crear una curva estándar y calcule los niveles de glucosa en función de la absorbancia de la muestra.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Prueba puntual de glucosa en orina

1. Coloque un trozo de Parafilm limpio sobre una superficie plana.
2. Levanta suavemente un ratón por la cola y colócalo en el Parafilm.
3. Sujete el ratón por el pescuezo con el pulgar y el índice. Levante suavemente al ratón mientras está sujeto por el pescuezo, lo que hace que el ratón orine como respuesta al estrés. Deje que una gota de orina caiga sobre la superficie del parafilm. Regrese el ratón a su jaula después de recoger la gota de orina.
4. Sumerja el extremo del reactivo de una tira de Diastix en la gota de orina fresca recogida en la superficie del Parafilm. Retire la tira inmediatamente y colóquela plana sobre una superficie con el lado del color hacia arriba. Espere al menos 30 segundos para que el color se desarrolle completamente en la tira. Compare el color desarrollado con la tabla de referencia proporcionada en el contenedor Diastix (Figura 1).
   Consejos: Si el ratón no orina en el Parafilm, aplique una presión suave en la parte inferior del abdomen del ratón (alrededor de la vejiga urinaria) con el dedo índice. Este enfoque ayudará a liberar las gotas de orina en el parafilm. Para los ratones que no orinan después de seguir el procedimiento descrito anteriormente, espere 20 minutos y vuelva a comenzar el procedimiento. Asegúrese de que todos los procedimientos se lleven a cabo mientras se adhieren a las pautas de IACUC.

>2. Recolección de orina de 24 h utilizando una jaula metabólica de ratón

1. Ensamble una jaula metabólica Tecniplast (Figura 2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Llene el conjunto de alimentación con comida en polvo y luego coloque el conjunto de alimentación en la lengüeta de metal apropiada en la cámara superior.
3. Fije el soporte de la botella de agua en la lengüeta metálica restante de la cámara superior.
4. Llene la botella de agua vacía y luego deslícela en el soporte de la botella, asegurándose de que el tubo del sorbo esté en el orificio.
5. Coloque un ratón en la jaula metabólica y luego cúbralo con una tapa.
6. Asegúrese de que la tapa de la jaula esté colocada correctamente.
7. Coloque un tubo de recolección de orina y un tubo de recolección de heces en sus lugares apropiados en el piso de la cámara inferior.
8. Después de 24 h, recupere el tubo de recolección de orina y realice un ensayo de glucosa para determinar la concentración de glucosa en orina. Si el ensayo de glucosa no se realiza el mismo día, congele la muestra de orina en el congelador a -80 °C.

>3. Determinación de la concentración de glucosa en orina durante 24 h

1. Si la muestra de orina se almacena a -80 °C, deje que la muestra se descongele antes de realizar un ensayo de glucosa.
2. A partir de un caldo de 100 mg/dl, prepare ocho patrones que van desde 25 mg/dl hasta 0 mg/dl de acuerdo con las instrucciones del kit de ensayo.
3. Prepare pocillos estándar y pocillos de muestras de orina en una placa de 96 pocillos, todos duplicados, de acuerdo con el manual del kit.
4. Después de iniciar la reacción añadiendo la cantidad recomendada de mezcla de enzimas a todos los pocillos, cubra la placa y déjela incubar durante 10 minutos a 37°C.
5. Absorción de lectura a 500-520 nm utilizando un lector de placas.
6. Analice los datos de acuerdo con las instrucciones del kit de ensayo. Represente la absorbancia de cada estándar frente a la concentración de glucosa y utilice el gráfico para determinar la concentración de glucosa de la muestra de orina de 24 horas.

Resultados

Figura 1. Prueba de glucosa en orina localizada. Las gotas de orina de ratón recogidas en Parafilm y la carta de referencia de colores proporcionada en el envase Diastix.

Figura 2. Jaula metabólica Tecniplast para la recogida de orina de ratón ...