Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de la proteína del antígeno HI del SARM
- Obtener clones del factor determinante de la superficie de la superficie del ion Fe B (IsdB) y del mutante de α-hemolisina (Hla) de fuentes comerciales (véase la Tabla de Materiales), realizar la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar los genes IsdB y Hla, y ligar sus productos al plásmido PGEX-6P-2 (obtenido comercialmente; véase la Tabla de Materiales). Cribado con la cepa vector Xl/azul de Escherichia coli.
- Transformar el clon positivo en células competentes para E. coli BL21 (ver Tabla de Materiales) y amplificar con cultivo de tiburones.
- Extraiga el antígeno y aísle después de la inducción con kits de aislados de isopropil-β-D-1-mercaptogalactopiranósido y cromatografía multimodal (MMC) (ver Tabla de materiales).
- Caracterice la proteína del antígeno y purifique con un purificador de automatización completa.
- Proteínas marcadas con gutatión S-transferasa (GST) purificadas por afinidad a partir de lisados aclarados utilizando una resina de cromatografía de afinidad disponible en el mercado (véase la Tabla de materiales).
- Purificar las proteínas recombinantes mediante isopropil-β-D-1-mercaptogalactopiranósido y cromatografía multimodal (MMC).
- Elimine la endotoxina mediante el método de separación de fases Triton X-114. Brevemente, mezcle Triton X-114 al 1% con eluido de proteína recombinante a 0 °C durante 5 min para asegurar una solución homogénea, e incube a 37 °C durante 5 min para permitir que se formen dos fases.
- Utilice el método de prueba de endotoxinas bacterianas con kits de tortugas (consulte la Tabla de materiales) para detectar la concentración de endotoxinas. La endotoxina para el antígeno proteico es de 0,06 UE/μg, inferior al estándar internacional (1,5 UE/μg).
- Realice una prueba de interferencia para eliminar la posible influencia del producto de prueba en la detección de endotoxinas.
nota: De acuerdo con el Apéndice 2020 de la farmacopea china, el contenido de endotoxinas debe ser inferior a 5 UE/dosis. La sensibilidad del lisado de Limulus (λ0,25 UE/ml) y la relación de dilución efectiva máxima de 33,3 se calcularon sobre la base de la dilución máxima válida, MVD = cL/λ, donde L es el valor límite de la endotoxina bacteriana para el artículo de ensayo, c es la concentración de la solución del artículo de ensayo, y cuando L se expresa en UE/m, c es igual a 1,0 mg/mL. λ es la sensibilidad marcada (UE/mL) del reactivo de cangrejo herradura en el método de gel.
- Recombinar el antígeno (48 kDa, determinado por electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida al 12% [SDS-PAGE]) a 1,5 mg/mL en agua estéril sin endotoxina ni solución salina tamponada con fosfato (PBS) (método del diclorato de sodio)
NOTA: El tiempo pico de la proteína fue de 13,843 min, la pureza fue del 99,4% (método de cromatografía líquida de alta resolución) y la proteína se almacenó a -70 °C. Se utilizó ADN genómico extraído de la cepa de S. aureus MRSA252 (ver Tabla de Materiales) como plantilla de PCR. El gen IsdB se amplificó utilizando el cebador directo 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
C-39 y el cebador inverso 59-TTTTCCTTTTGCGG
CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39.
El gen Hla se amplificó utilizando el cebador directo PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) y el cebador inverso PHLAR (TAAGCGGCCGCTTATCAATTTGTCATTTCTTC).
>2. Preparación de la vacuna contra la nanoemulsión
- De acuerdo con la proporción de masa de 1:6:3 (p/p), agregue tres tipos de excipientes en secuencia (miristato de isopropilo, aceite de ricino de polioxietileno y propilenglicol; consulte la tabla de materiales) a la solución de proteína de antígeno HI (10 mg / mL) y revuelva bien. A continuación, añadir agua pura esterilizada gradualmente hasta alcanzar un volumen final de 10 mL y agitar a 500 rpm y 25 °C durante aproximadamente 20 min.
nota: La nanoemulsión preparada en este protocolo tiene un volumen de 10 mL, y las masas de los tres excipientes son de 0,34 g, 2 g y 1 g, respectivamente. La solución proteica aquí es la solución de trabajo, 10 veces la concentración de la solución final.
- Preparar la vacuna adyuvante de nanoemulsión (1 mg/mL de proteína) mediante métodos de emulsificación de baja energía para obtener una solución líquida clara y transparente.
nota: La nanoemulsión en blanco (BNE) se preparó por métodos similares, excepto que el agua se reemplazó con HI. El método de emulsificación habitual consiste en calentar las fases exterior e interior hasta aproximadamente 80 °C para la emulsificación y luego agitarlas y enfriarlas gradualmente. En este proceso se consume una gran cantidad de energía y, finalmente, se obtiene la emulsión.
>3. Caracterización física y estabilidad de la vacuna adyuvante de nanoemulsión
- Caracterización del tamaño de partícula, potencial zeta e índice de dispersión polimérica (PDI).
- Prepare 100 μL de la vacuna adyuvante de nanoemulsión y diluya 50 veces con agua para la inyección. Agregue 2 mL de muestra para la detección.
- Observe los tamaños de partícula, el potencial zeta y el PDI a 25 °C utilizando un Nano Zetasizer (ZS; ver Tabla de Materiales).
- Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
- Diluir 10 μL de vacuna de nanoemulsión 50 veces con agua, colocar sobre una rejilla de cobre de malla 100 recubierta de carbono y teñir con ácido fosfotúngstico al 1% (ver Tabla de Materiales) durante 5 min a temperatura ambiente.
- Retire el exceso de solución de ácido fosfotúngstico con papel de filtro.
- Observe la morfología bajo un microscopio electrónico de transmisión (ver Tabla de Materiales). Examine si los productos terminados son casi estables y circulares dentro del campo de visión del microscopio electrónico y si exhiben una buena dispersión.
- Microscopía electrónica de barrido (SEM)
- Diluir 10 μL de la vacuna adyuvante de nanoemulsión 50 veces con agua, dejar caer 10 μL de muestras prediluidas en una oblea de silicio y colocar en una incubadora controlada por termostato a 37 °C durante 24 h.
- Rocíe el platino preparado sobre el silicio durante 40 s y enfríe a temperatura ambiente.
- Observar las propiedades morfológicas de las muestras preparadas bajo un microscopio electrónico de barrido de alta resolución (ver Tabla de Materiales). Determine si las muestras son casi estables, esféricas y bien dispersas dentro del campo de visión bajo el microscopio electrónico.
- Estabilidad morfológica
- Coloque 1 mL de muestras de vacuna de nanoemulsión en tubos de microcentrífuga y evalúe la estabilidad de las muestras frescas centrifugando durante 30 min a 13.000 x g a temperatura ambiente (25 ° C).
- Observe el aspecto de estas muestras frescas y luego realice una prueba de estabilidad termodinámica de seis ciclos de temperatura (un ciclo: almacenar a 4 °C durante 48 h, 25 °C durante 48 h y 37 °C durante 48 h).
- Después de la centrifugación, deje reposar las muestras durante 15 minutos para determinar si hay un efecto Tyndall (si la muestra es clara y transparente bajo la luz) y si se ha producido una demulsificación (mostrada por una estratificación clara después de la demulsificación).
- SDS-PAGE y Western blot
- Agitar las muestras, mezclar una solución de 0,6 mL de etanol absoluto y 0,3 mL de vacuna, y centrifugar (13.000 x g, 30 min a temperatura ambiente, 25 °C).
- Transfiera el sobrenadante de la solución a un tubo limpio y disuelva el precipitado con 0,3 mL de agua. Obtener las soluciones de sobrenadante y precipitado (tanto la nanoemulsión en blanco como la vacuna) después del tratamiento con etanol absoluto y solución de agua destilada, y realizar la misma dilución de 50 veces.
- Mezcle 2,5 mL de gel de separación A y 2,5 mL de gel de separación B (consulte la Tabla de materiales), agregue 50 μL de persulfato de amonio al 10% y coloque rápidamente la solución en la placa de vidrio con una pipeta. Mezcle 1 mL de gel concentrado A y 1 mL de gel concentrado B, agregue 20 μL de persulfato de amonio al 10% en la placa de vidrio, inserte un peine del tamaño adecuado y espere la solidificación.
- Añadir un total de 5 μL de solución tampón de carga de proteínas 5x a la muestra diluida obtenida en el paso 3.5.2 y hervir la muestra durante 5 min.
- Agregue 10 μL de proteína calentada al pocillo correspondiente y agregue 5 μL de marcador de proteína al pocillo marcador.
- Conecte el electrodo, encienda el medidor de electroforesis (ver Tabla de Materiales) y ajuste el voltaje a 300 V. Apague la alimentación cuando la electroforesis alcance 1 cm de distancia de la parte inferior de la goma PAGE.
- Retire el gel y enjuague con agua bidestilada (ddH2O). Agregue la solución de tinción azul brillante G-250 de Coomassie (ver Tabla de Materiales) durante 10 min. Vierta la solución de tinción y enjuague el gel dos veces con la solución y la solución de decoloración disponible en el mercado y cocine el gel en el microondas durante 1 minuto. Agite el gel durante 10 minutos y cambie repetidamente la solución de decoloración hasta que el fondo del gel esté claro. A continuación, realice la toma de imágenes en gel (consulte la Tabla de materiales).
nota: El western blot se preprocesó, como se describe en los pasos 3.5.1-3.5.6.
- Remoje tres bloques de papel de filtro con un tampón de transferencia de electroforesis. Remoje la membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) en metanol durante 30 s y transfiérala con un instrumento de transferencia de gel semiseco (dos capas de papel de filtro, membrana de PVDF, gel de electroforesis y una capa de papel de filtro). Utilice un voltaje de 23 V para transferir la membrana durante 23 minutos.
- Retire la membrana de PVDF y lávela una vez con solución salina tampón Tris-Tween 20 (TBST) después de la transferencia.
- Coloque la membrana de PVDF en una solución de sellado (solución de leche desnatada en polvo al 5%) y selle durante la noche a 4 °C.
- Retire la membrana de PVDF y lave tres veces con TBST o 10 minutos cada una.
- Incubar con el anticuerpo primario (de ratones inmunizados con suero positivo). Diluir el anticuerpo primario (ver Tabla de Materiales) para ser analizado 500 veces (100 veces) con TBST. Coloque la membrana de PVDF bloqueada en el anticuerpo primario e incube a 37 °C durante 1 h.
- Retire la membrana de PVDF y lave tres veces con TBST durante 10 minutos cada una.
- Incubar con el anticuerpo secundario (ver Tabla de Materiales). Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con fosfatasa alcalina (AP) diluido 5.000 veces con TBST. Colocar la membrana de PVDF en el anticuerpo secundario e incubar a 37 °C durante 40 min.
- Retire la membrana de PVDF y lave cuatro veces con TBST durante 10 minutos cada una.
- Sumerja las membranas de PVDF en una mezcla (lo suficiente para empapar la membrana) del sustrato AP nitro blue tetrazol (NBT) y BCIP (5-bromo-4-cloro-3'-indolyfosfato p-sal de toluidina) (consulte la tabla de materiales) para teñir. Un resultado positivo es morado.
NOTA: Los resultados deben ser una banda de color púrpura transparente, y la tira de muestra y el peso molecular del antígeno deben estar en la misma posición etiquetada.
4. Evaluación de la respuesta inmunitaria de anticuerpos a esta vacuna después de la administración intramuscular
NOTA: Los ratones fueron inmunizados mediante inyección intramuscular de la vacuna de nanoemulsión después de un informe publicado. A los ratones se les administró PBS como control negativo. 1 semana después de completar tres inmunizaciones, se recolectó suero de los ratones. Los niveles séricos de IgG y las subclases de IgG1, IgG2a e IgG2b se determinaron cuantitativamente mediante un ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA).
- Recubrimiento de antígeno: Diluir el antígeno de la proteína HI a 10 μg/mL con solución de recubrimiento y añadir a la placa ELISA a 100 μL/pocillo. Incubar a 4 °C durante la noche.
nota: La solución de recubrimiento se prepara disolviendo 1,6 g de carbonato de sodio anhidro y 2,9 g de bicarbonato de sodio en 1 L de agua desionizada.
- Sellado: Lavar la placa (tres ciclos, cada ciclo 300 μL). Agregue 300 μL de la solución de sellado a cada pocillo y selle los pocillos durante 2 h a 37 °C.
nota: La solución de sellado se prepara mediante la adición de Tween-20 y albúmina sérica bovina (BSA) al PBS. El contenido de BSA en la solución PBST es del 1%.
- Dilución de suero: Diluir la muestra de suero de ratones 100 veces con PBST (tomar 3 μL de suero y agregarlo a 297 μL de PBST y vórtice), y usar 100 μL para cada muestra de suero. Diluya el suero positivo y el suero de control negativo 100 veces con PBST agregando 4 μL a 396 μL de PBST, luego mezcle por vórtice.
- Dilución de doble proporción: Agregue 200 μL del suero experimental diluido anteriormente a la primera fila de la placa ELISA recubierta y agregue 100 μL de PBST a todos los pocillos excepto a la primera y a la12ª fila. Realice una dilución 1:2 sucesivamente desde la primera fila: ajuste la pipeta a 100 μL, transfiera 100 μL de la primera fila a la segunda fila y mezcle con la pipeta 10 veces.
- Diluir el suero hasta la fila 11 en múltiples proporciones y desechar 100 μL de líquido.
- Agregue suero diluido negativo y positivo a los pocillos correspondientes en la fila 12 de acuerdo con la plantilla de muestra (ver Tabla 1)-100 μL/pocillo.
- Sellar las placas ELISA con una envoltura de plástico e incubar a 37 °C durante 1 h.
- Diluir el anticuerpo secundario anti-ratón IgG-HRP (ver Tabla de Materiales) con PBST a 1:10.000.
- Lave la placa (tres ciclos, cada ciclo 300 μL). A continuación, añadir 100 μL del anticuerpo secundario diluido a cada pocillo e incubar la placa a 37 °C durante 40 min.
- Tinción y terminación: Lavar la placa (cinco ciclos, cada ciclo 300 μL). Agregue 3,3′,5,5′-tetrametilbencidina (TMB) solución de tinción (100 μL; ver Tabla de Materiales) a cada pocillo. Coloque las placas a 37 °C durante 10 minutos lejos de la luz y, a continuación, finalice la reacción inmediatamente con 50 μL de 2 M H2SO4.
- Detecte el valor de densidad óptica (OD450) mediante un marcador enzimático (lea el valor OD450 dentro de los 15 minutos posteriores a la terminación).
Tabla 1: Secuencia de picos de ELISA y plantilla de dilución.
