1. Evaluación de la escisión o degradación de proteínas en el virus de la influenza A, células infectadas por IAV por caspasas
- Siembre 3 x 105 células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) o A549 por pocillo en una placa de cultivo celular de 12 pocillos.
nota: Si usa células MDCK, asegúrese de que el anticuerpo contra la proteína de interés reconozca su especie canina.
- Siembre los pocillos en pares, es decir, un par de control: un pocillo para la muestra simulada no infectada y otro para la muestra simulada infectada, un par de pruebas: un pocillo para la muestra A del inhibidor no infectado y otro para la muestra A del inhibidor infectado. Aumente el número de pares con cada inhibidor adicional.
- Incubar las células a 37 °C bajo una atmósfera de 5% de CO2 durante la noche.
- Al día siguiente, infecte las células con IAV (un subtipo H1N1 u otro subtipo).
- Para ello, prepare el inóculo del virus diluyendo el stock del virus en 400 μL de medio esencial mínimo (MEM) libre de suero (ver Tabla de Materiales) a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,5-3,0 unidades formadoras de placa (pfu)/célula (un factor de la duplicación del número de células al calcular el MOI).
nota: Para infectar las células MDCK, suplementar el inóculo del virus con tosilfenil fenilalanil clorometilcetona (TPCK)-tripsina a una concentración final de 1 μg/mL.
- Retire el medio de cultivo viejo de las células (paso 1.3) y lave las células con 1 mL/pocillo de MEM sin suero 2x.
- Añadir 400 μL de inóculo viral (paso 1.4.1) a las células e incubarlas durante 1 h a 35 °C bajo una atmósfera de 5% de dióxido de carbono (CO2).
- Mientras tanto, diluya un inhibidor de caspasas (por ejemplo, Z-DEVD-FMK), un inhibidor de lisosoma (por ejemplo, cloruro de amonio, NH4Cl) o un inhibidor del proteasoma (por ejemplo, MG132) (consulte la tabla de materiales) a una concentración final de 40 μM, 20 mM o 10 μM, respectivamente, en MEM sin suero (consulte la tabla de materiales). Los dos últimos inhibidores sirven como control. Diluir un volumen igual del disolvente (si no es agua) utilizado para reconstituir uno de los inhibidores en un medio libre de suero a modo de simulacro.
- Retire el inóculo del virus y lave las células como en el paso 1.5 (1x).
- Añadir el MEM sin suero, 1 mL/pocillo, simulado o suplementado con un inhibidor, a las células e incubar las células como en el paso 1.6. Este punto de tiempo se considera como infección de 0 h.
- Después de 24 h, recoja las células raspándolas con un émbolo de jeringa de 1 mL (lado de goma) y transfiérelas a un tubo de polipropileno de 1,5 mL.
- Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante 1-2 min a temperatura ambiente. Recoja el sobrenadante con una pipeta.
nota: Este sobrenadante podría desecharse o usarse para un ensayo de placa para medir el título de la progenie viral liberada.
- Lave el pellet de celda con 250 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) mediante recentrifugación como en el paso 1.11.
- Retire el sobrenadante y lise las células añadiendo 80-100 μL de tampón de lisis celular (50 mM de Tris (hidroximetil) clorhidrato de aminometano (THAM) (Tris-HCl), pH 7,4, 150 mM de cloruro de sodio (NaCl), 0,5% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 0,5% de desoxicolato de sodio, 1% de Triton X-100 y 1x cóctel de inhibidores de proteasa, ver Tabla de materiales) y vórtice.
- Calentar el tubo a 98 °C durante 10 minutos para lisar completamente y preparar el lisado celular total. Almacene los lisados a 4 °C para realizar los pasos 1.15-1.17 al día siguiente, pero, para obtener mejores resultados, termine estos pasos el mismo día.
- Calcule la cantidad de proteína en cada muestra utilizando un kit de ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (ver Tabla de Materiales).
- Resuelva cantidades iguales de proteínas de muestras infectadas y no infectadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS estándar (SDS-PAGE) junto con marcadores de peso molecular.
- Transfiera la proteína a una membrana de nitrocelulosa o difluoruro de polivinilideno (PVDF) (ver Tabla de Materiales)
nota: La membrana de PVDF puede dar un fondo alto en algunos generadores de imágenes de Western blot; Compruebe la compatibilidad.
- Realice Western blot para detectar la proteína de interés utilizando el método descrito en otra parte.
- Compare los niveles de proteínas en las líneas de muestras infectadas tratadas con simulacro y tratadas con inhibidores.
nota: Si el nivel de proteína se ha recuperado en el carril de muestra infectado tratado con inhibidor de caspasas, entonces la proteína es escindida o degradada por las caspasas. De lo contrario, es degradado por el lisosoma o el proteasoma.
- Cuantificar la recuperación de proteínas midiendo la intensidad de su banda en cada carril de al menos tres réplicas del mismo experimento y normalizándola con la banda de control de carga correspondiente.
- Utilice cualquier generador de imágenes contemporáneo y el software asociado (consulte la Tabla de materiales) para obtener imágenes de las transferencias de Western y cuantificar la recuperación de proteínas.
