1. Evaluación de la actividad antimicrobiana
NOTA: Todos los trabajos que involucren bacterias deben realizarse en condiciones estériles para evitar la contaminación del ensayo o del laboratorio. Todos los medios deben esterilizarse en autoclave antes de su uso, y los utensilios y equipos de plástico, como las pipetas, deben mantenerse estériles. Se recomienda que el trabajo se realice en una campana de biocontención (tipo 2).
- Estratificar las existencias de glicerol de las cepas bacterianas apropiadas para el andamio antibiótico en agar caldo de lisogenia (LB, preparado según las instrucciones del fabricante) y crecer durante la noche a 37 °C.
nota: La elección de las bacterias para probar la actividad antibacteriana debe hacerse en función del andamio antibiótico que se utilice. Se debe elegir un rango representativo de 5 a 10 bacterias de las especies que se sabe que son susceptibles al antibiótico, teniendo en cuenta las capacidades logísticas del laboratorio. Si es posible, también se deben analizar las bacterias resistentes. El protocolo que se proporciona a continuación funcionará en la mayoría de las bacterias, pero verifique si se requieren condiciones especiales (por ejemplo, CO2, medios especiales) y realice las modificaciones necesarias. Las bacterias analizadas con éxito con estas condiciones incluyen estafilococos, estreptococos, bacilos, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa y Enterococcus faecium.
- Elija una sola colonia de la placa y cultive durante la noche en 5 mL de caldo Mueller-Hinton ajustado a cationes (CAMHB, preparado según las instrucciones del fabricante) a 37 °C.
- Diluir los cultivos durante la noche ~ 40 veces en CAMHB y crecer hasta una fase logarítmica media, densidad óptica a 600 nm (OD600) = 0,4-0,8, volumen 5 mL).
- Prepare soluciones madre de cada antibiótico fluorescente a 1,28 mg/mL en agua estéril y pipetee 10 μL de antibiótico en la primera columna de una placa de 96 pocillos.
- Agregue 90 μL de CAMHB a la primera columna y 50 μL a todos los demás pocillos. A continuación, realice una dilución en serie de 2 veces en toda la placa.
- Mezcle bien, luego diluya los cultivos de fase media logarítmica a ~ 106 unidades formadoras de colonias (UFC)/mL y agregue 50 μL a todos los pocillos, para proporcionar una concentración final de ~ 5 x 105 UFC/mL.
volumen de cultivo (mL) = (volumen del medio en mL)/(OD600 x 1.000)
por ejemplo, para un diámetro exterior de600 = 0,5 de cultivo en un volumen de medio deseado de 12 mL, añada (12/(0,5 x 1.000) = 0,024 mL de cultivo a 12 mL de medio
- Cubra las placas con tapas e incube a 37 °C durante 18-24 h sin agitar.
- Inspeccione visualmente las placas, siendo el MIC el pozo de concentración más baja sin crecimiento visible.
nota: En la Tabla 1 se muestran algunos ejemplos de antibióticos fluorescentes activos e inactivos.
>2. Análisis de la acumulación de sondas por espectrofotometría
NOTA: Estos tiempos de centrifugación se han optimizado para E. coli, por lo que pueden ser necesarias ligeras alteraciones para otras especies. Se informan datos representativos de la acumulación de sonda para la sonda de ciprofloxacina marcada con NBD.
- Vierta las existencias de glicerol de las cepas bacterianas en agar LB y crezca durante la noche a 37 °C.
- Elija una sola colonia de la placa y cultive durante la noche en LB a 37 °C.
- Diluya los cultivos durante la noche ~50 veces en el medio y crezca hasta la fase media del registro (OD600 = 0,4-0,8).
- Centrifugar los cultivos a 1.470 x g durante 25 min y decantar el medio.
- Vuelva a suspender las bacterias en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), luego centrifugue a 1,470 x g durante 15 minutos.
- Decantar el medio y volver a suspender los gránulos lavados en PBS hasta un OD finalde 600 = 2.
- Si lo desea, agregue 10,1 μL de cianuro de carbonilo 3-clorofenilhidrazona (CCCP, 10 mM en PBS) a 1 mL de bacterias (concentración final de 100 μM) e incube a 37 °C durante 10 min.
nota: El CCCP es un inhibidor de la bomba de eflujo. La adición de CCCP permitirá examinar el impacto de la eflujo.
- Centrifugar los cultivos a 18.000 x g durante 4 min a 20 °C y decantar el medio.
- Añada 1 ml de solución antibiótica fluorescente (10-100 μM en PBS) al pellet e incube a 37 °C durante 30 min.
- Centrifugar los cultivos a 18.000 x g durante 7 min a 4 °C y decantar el medio.
- Vuelva a suspender las bacterias en 1 ml de PBS frío y repita el paso 2.9.
- Repita el paso 2.10 un total de 4 veces.
- Si lo desea, lise las bacterias añadiendo 180 μL de tampón de lisis (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0 y 2 mM de EDTA sódico) y luego 70 μL de lisozima (72 mg/mL enH2O).
- Incubar a 37 °C durante 30 minutos, luego congelar y descongelar 3 veces (-78 °C durante 5 minutos, luego 34 °C durante 15 minutos).
- Sonicar las muestras durante 20 min, luego calentar a 65 °C durante 30 min.
- Centrifugar las muestras lisadas (18.000 x g, 8 min) y, a continuación, filtrar a través de una membrana filtrante de 10 kDa.
- Lave el filtro las 4 veces con 100 μL de agua.
- Transfiera el lisado a una placa negra de 96 pocillos de fondo plano y mida la intensidad de fluorescencia en un lector de placas con longitudes de onda de excitación y emisión apropiadas para el fluoróforo (es decir, 7-(dimetilamino)-2-oxo-2H-cromado-4-il [DMACA]: λex = 400 nm, λem = 490 nm; nitrobenzoxadiazol [NBD]: λex = 475 nm, λem = 545 nm).
nota: En la Figura 1 se muestran ejemplos de análisis espectrofotométricos de bacterias utilizando el antibiótico ciprofloxacino fluorescente marcado con NBD.
