Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Recolección de pellets fecales frescos
- Prepare toallas de papel estériles, pinzas de punta roma y tubos cónicos de 50 ml.
- Coloque algunas toallas de papel y pinzas en bolsas de autoclave separadas y tóquelas en autoclave a 180 °C en calor seco durante 30 min. Utilice también tubos cónicos estériles. Pesa los tubos cónicos y anota su peso en los tubos.
- Encienda el gabinete de bioseguridad en la habitación de los animales.
- Tome una jaula de ratón limpia y esterilizada en autoclave sin ropa de cama y colóquela en el gabinete de bioseguridad. Retire la tapa y el estante para alimentos y colóquelos dentro del gabinete.
- Coloque algunas toallas de papel estériles en el fondo de la jaula y vuelva a colocar la rejilla de metal encima de la jaula.
- Identifique a los donantes fecales de la misma edad y coloque la jaula del ratón en el gabinete de bioseguridad. Abra la jaula y agarre suavemente un ratón donante (C57BL/6J) por la cola y colóquelo en la rejilla de metal encima de la jaula limpia.
- Coloque la tapa de la jaula encima del estante y espere a que los animales defequen.
NOTA: Coloque algunos compañeros de camada de ratones en el estante simultáneamente.
- Recoja los gránulos fecales y colóquelos en un tubo cónico estéril de 50 ml. Agrupar los pellets por sexo. No mezcle gránulos fecales recolectados de machos y hembras.
- Vuelva a pesar el tubo y calcule el peso de los gránulos fecales.
>2. Preparación de la suspensión fecal
- Prepare una solución estéril (10% de glicerol en solución salina normal).
- Agregue 10 mL de glicerol al 10% / solución salina normal al tubo cónico por cada gramo de gránulos fecales.
NOTA: Aumente el volumen de la solución a 20 ml si es necesario. En este estudio también se utilizó 1 mL de solución para cada pellet (5-10 mg).
- Homogeneizar la mezcla a baja velocidad con un homogeneizador de sobremesa o una licuadora dentro de una campana extractora para resuspender las heces (3 X 30 s).
- Filtrar la suspensión fecal a través de 2 capas de gasa de algodón estéril (10,2 cm x 10,2 cm). Almacene el filtrado temporalmente en un refrigerador durante un máximo de 6 h o envuélvalo en viales criogénicos estériles y guárdelo en un congelador a -80 °C.
- Limpie a fondo el homogeneizador o la licuadora siguiendo un procedimiento estándar.
>3. Administración de suspensión fecal por sonda nasogástrica oral
- Descongele la suspensión fecal congelada en hielo si usa muestras congeladas. Mezcle la suspensión fecal descongelada por vórtice.
- Transfiera la suspensión fecal fresca o descongelada a jeringas de 1 mL.
NOTA: Cada ratón recibirá un total de 200 μL de suspensión fecal, y cada ratón IL-10-/- del grupo de control recibirá 200 μL de glicerol al 10%/solución salina normal.
- Pese los ratones y elija el tamaño correcto de la aguja de sonda nasogástrica y el volumen máximo de dosificación.
NOTA: Para ratones con un peso corporal entre 20 y 25 gramos, utilice una aguja sonda sonda curva de 20 G y 3,81 cm con una bola de 2,25 mm. Consulte gavageneedle.com para obtener más información.
- Pruebe la aguja de sonda nasogástrica midiendo la longitud desde la punta de la nariz del ratón hasta la apófisis xifoides (parte inferior del esternón). Llene la jeringa con glicerol/solución salina al 10% o suspensión fecal y elimine las burbujas de aire dentro de la jeringa y la aguja.
NOTA: Si la aguja es más larga que la longitud, coloque una marca en el vástago/tubo de la aguja a la altura de la nariz. No pase la aguja/tubo a través del animal más allá de ese punto para evitar la perforación gástrica.
- Coloque una jaula de ratón en el gabinete de bioseguridad, retire la cubierta de plástico de la jaula y deje el estante de metal en su lugar.
- Agarra un ratón por la cola y colócalo en la rejilla metálica. Sostenga al ratón por la cola con una mano y use los dedos pulgar y medio de la otra mano para sujetar al animal agarrando la piel por encima de los hombros. De esta manera, las patas delanteras se estiran hacia los lados, lo que evitará que las patas delanteras empujen la aguja hacia afuera. Extienda suavemente la cabeza del animal hacia atrás y sostenga la cabeza en su lugar con una mano.
NOTA: Practique el manejo del ratón hasta que el experimentador tenga plena confianza antes de continuar con el experimento.
- Coloque la aguja sonda en la parte superior de la lengua dentro de la boca. Avance suavemente a lo largo del paladar superior hasta que la aguja llegue al esófago. Pase la aguja suavemente con un solo movimiento. No fuerce la aguja si siente alguna resistencia. Saca la aguja y vuelve a intentarlo.
- Una vez que la aguja esté correctamente colocada y verificada, administre lentamente el material empujando la jeringa conectada a la aguja. No gire la aguja ni la empuje hacia adelante, lo que puede romper el esófago. Después de la dosificación, extraiga suavemente la aguja.
- Regresa el ratón a su jaula de origen. Vigile al animal durante 5 a 10 minutos buscando signos de dificultad para respirar o angustia. Vuelva a monitorizar a los ratones entre 12 y 24 h después del TMF.
