1. Generación de células madre pluripotentes inducidas
- Cultivo de fibroblastos humanos en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) en placas de 6 pocillos.
- Antes de comenzar la reprogramación de los fibroblastos, cubra los 6 pocillos con Matrigel e incube durante al menos una hora a temperatura ambiente. Con una confluencia del 80%, retire los medios de los cultivos de fibroblastos y lávelos una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x.
- Añadir suficiente tripsina-EDTA al 0,25% para cubrir toda la placa e incubar a 37 °C durante 10 min.
- Una vez que las células se hayan desprendido de los pocillos, agregue el doble de la cantidad de DMEM con 10% de FBS que la de tripsina para saciar la digestión de la tripsina. Pipetea suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo para romper las células. Cuente el número de células individuales con un hemocitómetro.
- Transfiera 7 x 105 celdas a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugue la suspensión de celdas a 200 x g durante 5 min.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en la solución de electroporación. Electroporar los fibroblastos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Vuelva a suspender las células en 100 μl de tampón de electroporación y agregue 1 μg de cada vector episomal. Celdas electroporadas con ajustes de 1.650 V, 10 ms y 3 pulsos de tiempo.
- Transfiera la suspensión de la célula al medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de FBS y placa 5 x 104 celdas por pocillo de una placa de 6 pocillos. Placas de incubación a 37 °C y 5% de CO2.
- Después de 48 horas, retire el medio de los cultivos de fibroblastos transfectados y reemplácelo con el medio mTeSR. Reemplace los medios de cultivo diariamente hasta que las colonias de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) estén listas para ser aisladas. Las colonias de iPSC se pueden observar después de 28-35 días.
- Cuando esté listo para el aislamiento, corte mecánicamente una colonia de iPSC y vuelva a sembrar en medio mTeSR con un inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK) de 10 μM (Y-27632) en una placa de 6 pocillos recubierta de Matrigel. Reemplace el medio de cultivo diariamente.
>2. Inducción Neuronal y Mantenimiento de NPCs Humanos
- Cuando los cultivos de iPSC estén alrededor del 20% de confluencia, retire el medio mTeSR y reemplácelo con un medio de inducción neural. Reponga el medio cada dos días.
- Después de 7 días, retire el medio de inducción neuronal y reemplácelo con un medio de mantenimiento NPC humano. Reponga el medio cada dos días hasta 7 días antes del paso de los cultivos.
- Antes de pasar los cultivos, cubra las placas/matraces con Matrigel a temperatura ambiente durante al menos una hora.
- Retire los medios de los cultivos NPC humanos confluentes y lávelos una vez con 1x PBS, luego aspire el PBS.
- Agregue suficiente solución de desprendimiento de celda para cubrir todos los pocillos y luego incube durante 5 minutos a 37 °C.
- Asegúrese de que todas las celdas se hayan separado. Agregue el doble de la cantidad de DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12) que la de la solución de desprendimiento de células a los pocillos/matraces.
- Transfiera las células que contienen DMEM/F-12 a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugue a 200 x g durante 5 min.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 5 ml de medio de mantenimiento NPC humano. Pipetea suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo para romper las células.
- Coloque un tercio del total de células en pocillos/matraces de cultivo recubiertos de Matrigel y rellene suficiente medio suplementado con 10 μM Y-27632. Incubar los recipientes de cultivo a 37 °C y 5% de CO2.
- Divida los cultivos 1:3 cada 3 a 4 días y reponga el medio cada dos días. Mantenga las culturas de NPC humanos a alta densidad para evitar la diferenciación.
>3. Diferenciación de NPCs Humanos en Neuronas en Co-cultivos
- Agregue el vector lentiviral Synapsin1-tdTomato al cultivo NPC humano antes de iniciar la diferenciación en neuronas. Prepare los cocultivos de astrocitos/neuronas corticales con un día de anticipación antes de diferenciar las NPC humanas.
- Lave los cultivos de NPC humanos una vez con 1x PBS y agregue suficiente solución de desprendimiento de celdas para cubrir todos los pocillos/matraces y luego incube durante 5 minutos a 37 °C.
- Asegúrese de que todas las celdas se hayan separado. Añada el doble de la cantidad de DMEM/F-12 que la de la solución de desprendimiento de celda a los pocillos/matraces. Transfiera a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 200 x g durante 5 min.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml de medio de diferenciación neuronal. Pipetee suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo para dividir la peleta celular en celdas individuales. Cuente el número de células individuales con un hemocitómetro.
- Aspire cuidadosamente el medio de cultivos de astrocitos/neuronas corticales. Placa de NPC humanos a 5 x 103 células/cm2 en 500 μl de medio de diferenciación neuronal suplementado con 10 μM Y-27632 por cada 24 pocillos. Agregue suavemente medio que contenga NPC humanos en cada pocillo para evitar perturbar los astrocitos y las neuronas corticales.
- Placas de incubación a 37 °C y 5% de CO2. Reemplace la mitad del medio con medio nuevo cada dos o tres días durante al menos 28 días.
