Un modelo de gran alcance para los cuidados perioperatorios y críticos relacionados con la insuficiencia renal aguda se presenta. Utilizando todo el cuerpo hipoperfusión inducida por paro cardíaco, es posible reproducir casi los cambios histológicos y funcionales de la clínica AKI.
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Artículo de método
Arresto normotérmica cardiaca y reanimación cardiopulmonar: un modelo de ratón de la lesión por isquemia-reperfusión
En este artículo
Resumen
Resumen
La lesión renal aguda (IRA) es un común, altamente letal, complicación de la enfermedad grave que tiene una alta mortalidad 1-4 y que es más frecuentemente causada por la hipoperfusión de todo el cuerpo. 5,6 reproducción exitosa de la hipoperfusión en todo el cuerpo-en modelos de roedores ha estado plagado de dificultades. 7-9,9,10 modelos que emplean la isquemia focal han demostrado repetidamente que los resultados no se traducen en la práctica clínica, y más modelos animales que permiten acceder a la falta de cuerpo entero hipoperfusión al conjunto de herramientas completo de la manipulación genética posible en el ratón. 11,12 Sin embargo, en los últimos años un modelo de ratón de un paro cardíaco y resucitación cardiopulmonar se ha convertido en lo que se puede adaptar el modelo de la IRA. 13 Este modelo reproduce de forma fiable los resultados fisiológicos y funcionales, anatómicos e histológicos visto en la práctica clínica AKI , es repetible rápidamente, y ofrece todas las ventajas de un modelo murino quirúrgica, incluido el acceso a técnicas de manipulación genética, en relación de bajo costo para animales de gran tamaño, y facilidad de uso. Nuestro grupo ha desarrollado una amplia experiencia con el uso de este modelo para evaluar una serie de órganos específicos en los resultados AKI 14,15.
Protocolo
Todos los procedimientos descritos se llevan a cabo de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud directrices para el cuidado y uso de animales en la investigación y todos los animales protocolos fueron aprobados por la Oregon Health & Science de la Universidad de Cuidado de Animales institucional y el empleo.
1. Preparación quirúrgica
- Pesar el ratón. El procedimiento descrito se lleva a cabo en ratones C57BL / 6 que pesan entre 20 y 25 g. La anestesia es inducida en una caja de inducción con isoflurano 3.4%, y posteriormente mantuvo con 1,5-2,5% de isoflurano en la mezcla de aire / oxígeno.
- Lubricar los ojos y la posición supina de los animales en un cojín de la calefacción. Inmovilizar cuatro extremidades con cinta adhesiva. Las patas traseras, se puede grabar en una posición neutral, sin embargo, las patas delanteras deben ser asegurados lo más cerca posible de la pared torácica como sea posible para permitir excursión de la pared torácica durante las compresiones torácicas.
- Lubricar y colocar una sonda de temperatura rectal. La temperatura se controla mediante una almohadilla eléctrica y la lámpara conectada a un controlador electrónico de temperatura (Digi-Sense, Cole Parmer, Vernon Hills IL), que contempla el mantenimiento de 37,0 ° C. Debido a que es posible que un gradiente de temperatura en el animal puede desarrollar durante el estado de no-flujo, es importante que la temperatura se mide y controla cerca del órgano de interés.
- Intubar la tráquea con un 2.5 de 22 cm ga catéter de teflón (Insyte-W, BD, Franklin NJ) y el extremo del corte distal de un introductor en ángulo (Frova Introductor, Médico Cook, Bloomington IN). Otros métodos de intubación traqueal son aceptables, sin embargo, el uso del introductor en ángulo permite un posicionamiento adecuado en el cuello en una posición ligeramente extendida, que optimiza la exposición quirúrgica para la colocación del catéter intravenoso. La conexión del catéter endotraqueal se asegura con un lazo de sutura para el incisivo y se mantiene con una ligera tensión para inmovilizar la cabeza durante las compresiones torácicas.
- Ventilar mecánicamente el ratón con un ventilador de roedores conjunto a 140 l, 150 respiraciones / minuto. Esto no es ajustado por el peso de este protocolo se realiza siempre en 20-25 g animales. No se exceda en profundizar la anestesia. No coloque el ventilador para aplicar la presión espiratoria final, ya que perjudica la resucitación.
- Utilizando una técnica estéril y de un microscopio, un lugar pre-lavado PE-10 del catéter en la vena yugular. Cualquiera de las partes puede ser utilizado, pero el uso de la parte más cercana al operador reduce la posibilidad de desprendimiento del catéter durante las compresiones en el pecho u otras manipulaciones. 0,5% bupivicaína, 0,1 mL es infitrated en bordes de la herida para controlar el dolor postoperatorio.
- Asegure el catéter PE-10 en el cierre de la piel con un adhesivo de cianoacrilato quirúrgico.
- Lugar subcutánea electrodos de EKG y conectarse a un dispositivo de vigilancia. Atención a la trayectoria de la señal y la maximización de la propia señal es crucial para el éxito de la reanimación. Asegúrese de que todos los cables se fijan a la superficie de trabajo, reducir al mínimo los cruces de la señal, y minimizar los aislantes (como el aire de agujas huecas o cable trenzado) en el camino de la señal. Agujas sólidas conectado a cable nonstranded puede ser comprado o hecho en el laboratorio. Una vez conectado, optimizar la señal de ECG en el monitor.
2. Paro cardíaco
- Asegúrese de que el ratón es normotérmica, que se define como la temperatura rectal de 36,5 º C - 37,5 ° C. Administrar 40 ml de la temperatura ambiente 0,5 M de cloruro de potasio por vía intravenosa y observar isoeléctrico trazado en el ECG. Ajuste de la dosis para el peso no es necesario dentro del rango de 20 a 25 g. Iniciar el temporizador de detención.
- Desconecte el respirador artificial. Interrumpir el vapor anestésico. Apague el cojín de la calefacción y cualquier otro equipo que produce el ruido electrónico que puede interferir con la monitorización ECG. Coloque una capa aislante sobre el ratón.
- Registrar la temperatura cada minuto durante el paro cardiaco. Si es necesario, una lámpara de calor se puede utilizar para llevar la temperatura central hasta el rango normotérmica. Durante un paro cardiaco, preparar materiales y equipos (por ejemplo, la jeringa de epinefrina) para la reanimación. Una lista de verificación puede ser útil para garantizar la reanimación sin interrupciones, lo cual es esencial para la supervivencia.
- Después de 7 minutos y 30 segundos de un paro cardíaco, vuelva a conectar el ventilador y aumentar la tasa a 180 respiraciones / min, manteniendo el volumen de marea en la fase previa al arresto.
- A los 8 minutos, iniciar compresiones de pecho a 300 BPM. Artefactos de movimiento en el ECG se puede utilizar para juzgar la tasa de RCP. Compresiones torácicas debe ser entregado con el dedo índice, de 5 mm por encima de la apófisis xifoides y ligeramente a la izquierda de la línea media. El pecho debe ser comprimido 1.3 a 1.2 de la distancia anteroposterior y el retroceso completo se debe permitir que entre las compresiones. Posición de los dedos y la presión de compresión óptimo son absolutamente críticos. La imposibilidad de lograr la supervivencia en este modelo es casi siempre debido a las óptimas CPR.
- Infundir 0,5 ml de epinefrina, diluida a 15 mg / ml, en los primeros 30 segundos de RCP. Dosis de adrenalina total es de 8.12 mg. Observe cuidadosamente el ECG para el retorno de la circulación espontánea (ROSC). Estrecha complejo QRS se ven entre los artefactos de compresión. ROSC ocurre generalmente entre 90 segundos y 2 minutos después de comenzar la RCP. Reanimación es abandonada si ROSC no se produce por 3 minutos. Contracciones ventriculares prematuras frecuentes y los cambios en el ECG eje se observan en los primeros 2 minutos después de ROSC, y casi siempre se resuelven en la taquicardia sinusal estable en 2 minutos.
- Registrar el tiempo total de reanimación y la dosis de epinefrina. Registran la temperatura cada minuto durante 10 minutos después de ROSC.
- Lleva EKG puede ser removido cuando la respiración espontánea se inicia, por lo general en 12-15 minutos después de ROSC.
- Retirar la intubación de la tráquea cuando la frecuencia respiratoria espontánea> 60/min.
- Coloque el ratón en una jaula de recuperación en una superficie de temperatura controlada conjunto a 37 ° C durante las primeras 2 horas después del procedimiento, lo que garantiza un fácil acceso a los alimentos y el agua. La jaula se puede trasladar a las condiciones estándar de vivienda postoperatorio cuando el ratón se ha recuperado completamente de la anestesia y está activo.
3. Exanguinación / perfusión-fijación y la cosecha del Riñón
- 24 horas después de la CA / RCP, inducir la anestesia con isoflurano al 3-4% y seguro que el animal en decúbito supino sobre una superficie quirúrgico dentro de una campana extractora que es apropiado para su uso con formol ..
- Profundizar la anestesia, aumentando gradualmente la concentración de vapor anestésico a un 5% y garantizar que el ratón está profundamente anestesiados como se evidencia por el cese de la respiración espontánea.
- Realizar una toracotomía cubierta y exsanguinate el ratón a través de la punción apical del ventrículo cardíaco izquierdo de acuerdo con técnicas estándar.
- A través de la misma aguja, administrar salina al 0,9% en infusión lenta. Para acclerate perfusión / desangrado, nick de la orejuela derecha con unas tijeras. Realizar una laparotomía y observar los riñones. Cuando se blanquean, solución salina puede ser cambiado a un 4% de formol para su fijación. Los riñones son luego incluidos en parafina y teñidas con B fluoro-jade para la cuantificación de la necrosis del epitelio tubular.
4. Los resultados representativos:
Cuando se induce CA, la presión arterial media (PAM) y la regional del flujo renal sanguíneo (RRBCF) gota a cerca de cero y permanece estable hasta la reanimación comienza (Figura 1). 24 horas después de la CA / RCP, los índices de suero de la función renal (nitrógeno ureico en sangre, creatinina y BUN) son significativamente elevados en relación con operación simulada animales. AST / ALT también son elevados, ofreciendo evidencia de la profunda de todo el cuerpo isquemia (Figura 2). Neutrófilos gelatinasa lipocalina asociada (NGAL), un indicador sensible de la lesión isquémica renal es masivamente upregulated después de 24 CA / CPR (Figura 3). Por último, microfotografías demuestran la necrosis parcheada, medular típico de lesión renal isquémica con el adelgazamiento del epitelio tubular y el relleno luminal de hematoxilina y eosina (Figura 4, panel a) y una extensa muerte celular en el epitelio tubular medular cuando se tiñen con B fluoro-jade ( Figura 4, panel b).
Figura 1. Paro cardíaco induce la pérdida inmediata de la presión de perfusión, representado aquí como la presión arterial media (PAM), medido en la arteria femoral, lo que resulta en casi completo cese de la regional del flujo sanguíneo renal cortical (RRCBF) durante todo el período de paro cardíaco (la sombra área). Reanimación con masaje cardíaco y epinefrina retorna a la normalidad y MAPA RRCBF constantemente se levanta en el periodo de reanimación post. Reproducido con permiso del 14.
Figura 2. 24h después del procedimiento, nitrógeno ureico en sangre (BUN), creatinina sérica, y la extensión de la muerte de las células tubulares son significativamente más elevados en los animales que hayan sido CA / RCP en comparación con los animales tratados con un procedimiento simulado. CA / RCP induce una lesión isquémica pan-de organismos, aquí se evidencia por la elevación masiva de enzimas de función hepática alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) en CA / RCP ratones en comparación con el simulacro de los animales tratados.
Figura 3. Western blot realizado con anticuerpo policlonal de neutrófilos gelatinasa lipocalina asociada (NGAL), un indicador sensible de la lesión isquémica renal. Las muestras de orina fueron obtenidas inmediatamente antes ("pre") y 24 horas después ("24") CA / CPR en 4 animales (a, b, c, d, y más arriba). NGAL es enormemente aumentada en ratonesorina después de la CA / RCP. Reproducido con permiso del 14.
Figura 4. A) hematoxilina y eosina de una sección de eje corto de 24 hiliares tejido renal después de CA / RCP. Hay un daño irregular pero claro medular y corticomedular túbulos con tubular taponamiento. Las flechas señalan los túbulos dañados con núcleos hinchados, picnóticos en la unión corticomedular. B) B-jade flúor mancha de la misma región en el mismo animal, 24 horas después de CA / RCP. Jade fluoro-manchas B células necróticas de color verde brillante, mostrando irregular necrosis tubular corticomedular. Las flechas señalan los túbulos brillantes manchas dañado en la unión corticomedular. Estos resultados son sustancialmente similares a hallazgos de la biopsia renal de los seres humanos que desarrollan IRA, a diferencia de las producidas por otros modelos animales de IRA.
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Discusión
El modelo normotérmica de un paro cardíaco y resucitación cardiopulmonar en el ratón ofrece múltiples posibilidades de la evaluación en un modelo que reproduce la fisiopatología y la morfología de la causa clínica más frecuente de lesión renal aguda en todo el cuerpo hipoperfusión. Prueba de hipótesis puede ser ayudado por el acceso a un abanico de técnicas de manipulación genética y la anatomía bien entendido y se caracteriza y la fisiología de los ratones de laboratorio.
Como se describe a...
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| Cloruro de Potasio | Abbott Medical | 06653-5 | |
| Isoflurano | Abbott Medical | 05260-05 (y otros) | |
| De clorhidrato de epinefrina | Múltiple | Múltiple | |
| Digi-Sense controlador de temperatura | Cole-Palmer | EW-89.000-00 | |
| Angiocath IV Cath | VWR | 381134 | |
| Frova introductor vía aérea en ángulo | Cocinar | G27282 | |
| Ventilador MicroVent de ratones | Harvard Apparatus | 733591 |
Referencias
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