Imágenes de calcio en neuronas individuales que regulan el comportamiento de puesta de huevos en Caenorhabditis elegans

Resumen

Fuente: Ravi, B. et al., Imágenes radiométricas de calcio de neuronas individuales en Caenorhabditis elegans que se comportan. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra una técnica para obtener imágenes de calcio en neuronas individuales de Caenorhabditis elegans utilizando proteínas reporteras fluorescentes codificadas genéticamente. Describe los pasos involucrados en la obtención de imágenes del movimiento de los gusanos y la medición de las proporciones de fluorescencia reportera de las neuronas para correlacionar los niveles de calcio intracelular con la actividad neuronal y los cambios de comportamiento durante la puesta de huevos.

Protocolo

1. Cepas, medios de cultivo y montaje de animales

1. Cultive gusanos C. elegans a 20 °C en placas de agar estándar de 60 mm con medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con alimento bacteriano OP50 E. coli.
2. Prepare dos plásmidos para cada promotor de interés específico de la célula: uno, que impulsa la expresión de GCaMP5 para registrar Ca²⁺ intracelular, y el segundo, que impulsa la expresión de mCherry para permitir la cuantificación proporcional de los cambios de fluorescencia de GCaMP5 y simplificar la búsqueda y medición de objeto>nota: Las imágenes radiométricas GCaMP5:mCherry corrigen las fluctuaciones en la fluorescencia de GCaMP5 que resultan de cambios en el enfoque y el movimiento de los animales, no de cambios reales en el Ca²⁺ intracelular.
3. Inyecte plásmidos que expresen GCaMP5 y mCherry junto con el plásmido marcador de rescate visible pL15EK en las gónadas de los animales mutantes LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X y recupere animales no Muv lin-15(+) que expresen GCaMP5 y mCherry de un transgén de alta copia. Utilice el fondo mutante lite-1 para reducir el comportamiento de evitación de la luz azul.
4. Integrar transgenes a cromosomas para reducir el mosaicismo y simplificar la generación de cepas mutantes compuestas.
   nota: La cepa LX2004 descrita aquí porta un transgén integrado de alta copia que expresa GCaMP5 y mCherry en las HSN del promotor nlp-3 (ver Tabla de Materiales). Se encontró que el promotor de nlp-3 impulsa una fuerte expresión en los HSN de L4 tardíos y animales adultos sin causar defectos significativos en el desarrollo de HSN o el comportamiento de puesta de huevos en comparación con otros promotores probados (por ejemplo, tph-1, egl-6 y unc-86). Esta cepa y otras que expresan GCaMP5 y mCherry en las neuronas motoras del cordón ventral (VC), los músculos vulvares y las células neuroendocrinas uv1 están disponibles en el Centro de Genética de Caenorhabditis, y se han descrito detalles de su construcción.
5. Aplique el alimento bacteriano OP50 de una placa de agar NGM con semillas en el fondo de un pico de gusano de platino y utilícelo para transferir ~ 20 animales L4 LX2004 tardíos que expresan GCaMP5 y mCherry en los HSN del promotor nlp-3. Asegúrese de que la vulva en desarrollo aparezca en un microscopio estereoscópico como una mancha oscura clara rodeada por una media luna blanca. Incubar los animales a 20 °C durante 24-40 h.
6. Después de la incubación, aplique OP50 a la recolección y transfiera ~ 3 de los gusanos a una placa NGM sin semillas, dejando una pequeña cantidad de alimento para que los gusanos se alimenten durante la toma de imágenes. Asegúrese de que haya suficiente comida, ya que muy poca comida bacteriana alentará a los gusanos a alejarse del centro del plato, mientras que demasiada comida aumentará la fluorescencia de fondo y causará hipoxia.
7. Use una espátula plana y redondeada para cortar un trozo de ~ 20 mm x 20 mm de la placa que transporta los gusanos y transfiera el trozo boca abajo al centro de un cubreobjetos limpio de 24 mm x 60 mm # 1.5 (Figura 1). Comience la aplicación desde un lado para evitar que las burbujas queden atrapadas debajo del cubreobjetos e interfieran con la imagen. Aplique un cubreobjetos #1 de 22 mm x 22 mm en la parte superior del trozo para reducir la adherencia y la evaporación.

>2. Configuración de hardware e instrumentación

1. Coloque los gusanos transgénicos en etapa en la etapa de un microscopio invertido con un objetivo de ≥ 0.7 Numerical Aperture Plan-Apochromat 20x, etapa XY motorizada controlable con un joystick, un divisor de imagen y filtros de fluorescencia para la excitación y emisión simultánea de GCaMP5 y mCherry, cámaras para imágenes de fluorescencia e infrarrojo de campo claro, y un sistema de iluminación de diodo emisor de luz (LED) activable (Figura 2A).
   NOTA: Un divisor de haz 80/20 envía el 80% de la señal de imagen a la cámara de fluorescencia y el 20% a la cámara de campo claro. También se puede usar un microscopio vertical, pero el trozo de NGM debe colocarse entre un portaobjetos de vidrio y el cubreobjetos grande en este caso.
   1. Utilice los oculares binoculares para seleccionar un gusano para la obtención de imágenes. Cuando se selecciona un animal, deslice el filtro infrarrojo en su lugar sobre el condensador.
2. Disparadores de lógica de transistor-transistor (TTL)
   1. Conecte cables coaxiales desde cada una de las tres líneas de salida de disparo TTL de la cámara de fluorescencia. Conecte la primera salida a la entrada BNC #3 del sistema de iluminación LED.
   2. Conecte la segunda salida a un adaptador BNC 'banana' con cables verdes y marrones desde el conector GPIO de 8 pines que va a la entrada GPIO #3 (pin 4) y a tierra (pin 5) de la cámara infrarroja, respectivamente.
   3. Conecte la tercera salida a un adaptador BNC 'banana' con cables de puente que van a la entrada digital # 8 y a tierra en el dispositivo de adquisición digital (Figura 2B).
3. Dispositivo de adquisición digital (DAQ)
   1. Conecte la placa del microcontrolador DAQ (consulte la tabla de materiales) al PC mediante un cable USB. Actualice el firmware con el protocolo Firmata estándar (consulte la Tabla de materiales) y configure el puerto USB para comunicarse a 57600 baudios.
4. Leds
   1. Ejecute el software del controlador LED (consulte la tabla de materiales). Cambie el modo de disparo de 'Continuo' a 'Cerrado' y seleccione el canal de disparo '3' para los LED de 470 y 590 nm.
   2. Encienda e introduzca la alimentación del LED para cada LED (por ejemplo, configure el LED de 470 nm al 20% y el LED de 590 nm al 40%).
5. Ejecute el script de comunicación de etapa en serie 'XY-stage-final' en Bonsai (consulte la tabla de materiales). Haga clic en el nodo gris 'CsvWriter' y seleccione una carpeta para guardar la información de las etapas X e Y registradas (Figura 3). Presione la punta de flecha verde en la barra de herramientas para inicializar el archivo DAQ.
   nota: El script comenzará a registrar la posición de la etapa X e Y cuando la cámara de fluorescencia envíe una señal TTL. Este script genera cuatro columnas de datos: número de fotograma, posición X (μm), posición Y (μm) y el intervalo entre fotogramas (s).
6. En el software de grabación de la cámara infrarroja (consulte la Tabla de materiales), en 'Modos de video personalizados', seleccione "Modo 1" (agrupación 2 x 2; 1,024 x 1,024 píxeles) y "Formato de píxel Raw 8". En 'Disparador / Estroboscópico', establezca la línea de entrada del disparador (GPIO) en "3", la polaridad en "Alta" y el 'Modo' en "14". Alterne 'Habilitar' para detener la adquisición de fotogramas hasta que se reciba una señal de disparo TTL.
   1. Dejando esa ventana abierta, haga clic en el botón rojo "Grabar" en la barra de herramientas de la vista principal de la cámara. Seleccione la carpeta en la que se van a guardar las secuencias de imágenes. Seleccione el modo de grabación 'Buffered' y guarde 'Imágenes' en formato JPEG. Haga clic en "Iniciar grabación" para iniciar la adquisición.
7. Cámara de fluorescencia y divisor de imagen
   nota: Los canales de fluorescencia GCaMP5 y mCherry deben recogerse simultáneamente para garantizar un registro adecuado de la imagen para la cuantificación radiométrica. Un divisor de imagen permite la adquisición de dos canales de la fluorescencia GCaMP5 y mCherry en un sensor.
   1. En la pestaña "Captura" del software de adquisición de imágenes (consulte la Tabla de materiales), establezca el tiempo de exposición en 10 ms, la agrupación en 4x y la profundidad de la imagen en 16 bits. Seleccione un subarreglo de cámara centrado de 512 píxeles de ancho por 256 píxeles de alto. Haga clic en 'Mostrar opciones de activación de salida' y establezca todos los disparadores en 'Positivo'
      NOTA: El DAQ ocasionalmente puede omitir disparadores TTL si son de 10 ms o menos.
   2. Asegúrese de que 'Trigger 1' y 'Trigger 2' estén configurados en 'Exposición' mientras que 'Trigger 3' esté configurado en 'Programable' con un 'Período' de 25 ms. En la pestaña 'Secuencia', seleccione 'Lapso de tiempo' con un 'Retraso de campo1' de 50 ms para recopilar imágenes a 20 Hz. Seleccione 'Guardar en búfer temporal'.
8. Ganancia PMT e intensidad del láser durante la obtención de imágenes confocales de tres canales
   1. Ajuste la ganancia PMT para que la fluorescencia de fondo esté en un nivel justo por encima del mínimo (nivel de negro). Aumente la potencia del láser de 561 nm (verde) hasta que se observe un solo píxel saturado de 12 bits o 16 bits en el extremo presináptico en el canal mCherry.
   2. Ajuste la intensidad del láser de 488 nm (azul) para que la fluorescencia de GCaMP5 sea visible en el extremo presináptico sobre el fondo. Este ajuste bajo evita la saturación de los píxeles GCaMP5 cuando la fluorescencia aumenta en respuesta a fuertes transitorios de Ca²⁺. Abra el orificio confocal por completo para maximizar la captura de luz.

>3. Imágenes Ratiométricas Ca²⁺ y Registro de Comportamiento

1. En la pestaña "Secuencia" del software de adquisición de fluorescencia, haga clic en "Iniciar" para comenzar a grabar. Rastree el gusano con el joystick, manteniendo las células y sinapsis de interés enfocadas y en el centro del campo de visión (FOV). Haga clic en el botón 'Estadísticas' en la ventana del histograma para mostrar las estadísticas de píxeles de cada canal.
2. Ajuste la potencia del LED para garantizar una fluorescencia mCherry máxima de un solo píxel en el extremo presináptico de ≥ 8.000 recuentos (~ 4.000 fotoelectrones), lo que proporciona un rango dinámico de ~ 12 bits sobre el fondo (~ 100 fotoelectrones). Las señales de GCaMP5 en el extremo presináptico durante el reposo (bajo) de Ca²⁺ deberían ser de alrededor de ~ 2.500 recuentos, apenas visibles sobre el fondo.
3. Registre hasta que se alcance un estado activo de puesta de huevos; por lo general, esto ocurre cada 20-30 minutos en un gusano de tipo salvaje. Guarde un subconjunto de 10 minutos (12.001 fotogramas), 6.000 fotogramas antes y después del primer evento de puesta de huevos (fotograma 6.001). Asegúrese de mantener el mismo subconjunto de imágenes de campo claro del comportamiento del gusano y los puntos de tiempo de la posición de la etapa XY, o se perderá la sincronización precisa de los flujos de datos.
4. Utilice ImageJ y el complemento BioFormats (consulte la Tabla de materiales) para convertir secuencias de imágenes al formato Image Cytometry Standard (.ics) para que se pueda importar al software de cuantificación radiométrica.

Resultados

Figura 1. Técnica de montaje de C. elegans para obtener imágenes de alta resolución de la actividad y el comportamiento del circuito de puesta de huevos.Arriba, la montura final desde el lateral. En la parte inferior, la montura final vista a través de la parte inferior del cubreobjetos grande. Las flechas indican el alimento bacteriano OP50, los gusanos C. elegans ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Crecimiento, cultivo y cría de C. elegans
Cepa bacteriana de Escherichia coli, OP50	Centro Genético de Caenorhabditis	OP50	Alimento para C. elegans. Uracilo auxótrofo. E. coli B. Bioseguridad Nivel 1
HSN GCaMP5+mCepa de gusano cereza	Centro Genético de Caenorhabditis	LX2004	Transgén integrado que utiliza el promotor nlp-3 para impulsar la expresión de GCaMP5 y mCherry en HSN. Genotipo completo: vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
Cepa mutante Lite-1(CE314), Lin-15(N765TS) para la preparación de transgenes	autor	LX1832	Cepa para la recuperación de transgenes de alta copia después de la microinyección con plásmido de rescate pL15EK lin-15(n765ts). También lleva la mutación ligada lite-1 (ce314) que reduce la sensibilidad a la luz azul. Disponible del autor a petición
plásmido de rescate genómico pL15EK lin-15a/b	autor	pL15EK	Plásmido de rescate para la recuperación de animales transgénicos después de la inyección en LX1832 Cepa lite-1 (CE314), Lin-15 (N765TS) X. Disponible del autor a petición
plásmido pKMC299	autor	pKMC299	Plásmido para la expresión de mCherry en las HSNs del promotor nlp-3. Tiene nlp-3 3' región sin traducir
plásmido pKMC300	autor	pKMC300	Plásmido para la expresión de GCaMP5 en las HSNs del promotor nlp-3. Tiene nlp-3 3' región sin traducir
Fosfato de potasio monobásico	sigma	P8281	Para la preparación de placas NGM
Fosfato de potasio Dibasic	sigma	P5655	Para la preparación de placas NGM
Sulfato de magnesio heptahidratado	Amresco	662	Para la preparación de placas NGM
Cloruro de calcio dihidratado	Alfa Aesar	12312	Para la preparación de placas NGM
peptona	Becton Dickinson	211820	Para la preparación de placas NGM
cloruro de sodio	Amresco	Artículo 241	Para la preparación de placas NGM
colesterol	Alfa Aesar	A11470	Para la preparación de placas NGM
Agar, Bacteriológico Tipo A, Ultrapuro	Affymetrix	10906	Para la preparación de placas NGM
Placas de Petri de 60 mm	VWR	25384-164	Para la preparación de placas NGM
Micro cubreobjetos de 24 x 60 mm, #1.5	VWR	48393-251	Cubierta de vidrio a través de la cual se obtienen imágenes de los gusanos
Micro cubreobjetos de 22 x 22 mm, #1	VWR	48366-067	Cubreobjetos que cubren la parte superior del trozo de agar
Microscopio estereoscópico con base de luz transmitida	Leica	M50	Microscopio de disección para el mantenimiento, la estadificación y el montaje de la cepa de lombriz
Alambre de platino iridio, (80:20), 0,2 mm	ALFA AESAR	AA39526 blanco y negro	Para la transferencia de gusanos
Microscopio de imágenes de calcio
Mesa de aire antivibración	TMC	63-544	Mesa de laboratorio Micro-g' Mesa antivibratoria de 30" x 48" con CleanTop M6 de 4" en la parte superior de 25 mm
Microscopio compuesto invertido	Zeiss	431007-9902-000	Microscopio invertido Axio Observer.Z1
Sideport L80/R100 (3 posiciones)	Zeiss	425165-0000-000	Para desviar el 20% de la salida a la cámara de campo claro (CMOS) y el 80% a la cámara de fluorescencia (sCMOS)
Portaaviones de iluminación inclinable hacia atrás	Zeiss	423920-0000-000	Para imágenes infrarrojas/de comportamiento
Carcasa de la lámpara 12V/100W con colector	Zeiss	423000-9901-000	Para imágenes infrarrojas/de comportamiento
Lámpara halógena 12V/100W	Zeiss	380059-1660-000	Para imágenes infrarrojas/de comportamiento. Los LED de luz blanca no emiten luz infrarroja significativa, por lo que no permitirán imágenes de campo claro después del filtro de paso de banda infrarrojo
Filtro de paso de banda infrarrojo de 32 mm (750-790 nm) para lámpara halógena	Zeiss	447958-9000-000	BP 750-790; DMR 32mm, para iluminación infrarroja para campo claro y comportamiento
Torreta condensadora de 6 filtros (LD 0,55 H/DIC/Ph), motorizada	Zeiss	424244-0000-000	Para imágenes infrarrojas/de comportamiento
Condensador y obturador	Zeiss	423921-0000-000	Para imágenes infrarrojas/de comportamiento
Ocular binocular con fototubo para cámara CMOS infrarroja	Zeiss	425536-0000-000	Para imágenes infrarrojas/de comportamiento
Ocular 10x, 23mm	Zeiss	444036-9000-000	Para la localización de gusanos en el trozo de agar
Adaptador de montura C 2/3" 0.63x demagnificador	Zeiss	426113-0000-000	Soporte para cámara CMOS infrarroja
Cámara CMOS para campo claro infrarrojo y comportamiento (sensor de 1")	FLIR (anteriormente Point Grey Research)	GS3-U3-41C6NIR-C	Cámara para imágenes de campo claro
Tarjeta controladora de host USB 3.0	FLIR (anteriormente Point Grey Research)	ACC-01-1202	Fresco FL1100, 4 puertos
8 pines, cable GPIO de 1 m, conector circular Hirose HR25	FLIR (anteriormente Point Grey Research)	ACC-01-3000	Cable para disparo TTL. El cable verde se conecta a GPIO3 / Pin 4 y el cable marrón se conecta a tierra / Pin 5
Plan-Apocromático 20x/0.8 WD=0.55 M27	Zeiss	420650-9901-000	La mejor combinación de aumento, apertura numérica y distancia de trabajo
Torreta reflectora de 6 cubos, motorizada	Zeiss	424947-0000-000	Para la obtención de imágenes de fluorescencia
tren de luz de fluorescencia, motorizado	Zeiss	423607-0000-000	Para la obtención de imágenes de fluorescencia
Obturador de fluorescencia	Zeiss	423625-0000-000	Para la obtención de imágenes de fluorescencia
Cubo de filtro de doble excitación y emisión GFP y mCherry (para microscopio)	Zeiss	489062-9901-000	Juego de filtros FL 62 HE BFP+GFP+HcRed para imágenes de fluorescencia
Sistema de iluminación LED	Zeiss	423052-9501-000	Sistema LED Colibri.2 activable para iluminación fluorescente
Módulo LED GFP (470 nm)	Zeiss	423052-9052-000	LED Colibri.2 para excitación por fluorescencia GFP
Módulo LED mCherry (590 nm)	Zeiss	423052-9082-000	LED Colibri.2 para excitación por fluorescencia mCherry
Corredera de tope del iris para equipos de luz incidente	Zeiss	000000-1062-360	Apertura de campo del iris para limitar la iluminación LED al campo de visión de la cámara
Adaptador de montura C 1" 1.0x	Zeiss	426114-0000-000	Adaptador para divisor de imagen y cámara de fluorescencia sCMOS
Divisor de imágenes	Hamamatsu	A12801-01	Gemini W-View, se pueden usar otros divisores de imagen, pero es posible que no estén optimizados para el gran tamaño del sensor de las cámaras sCMOS
GFP / Espejo dicroico mCherry (divisor de imagen)	Semrock	DI02-R594-25x36	División de GCaMP5 de señales mCherry e infrarrojas
Filtro de emisión GFP (divisor de imagen)	Semrock	FF01-525/30-25	Captura de fluorescencia GCaMP5
mCherry/ filtro de emisión (divisor de imagen)	Semrock	FF01-647/57-25	Este filtro es necesario para excluir la luz infrarroja utilizada para las imágenes de campo claro
Cámara sCMOS para fluorescencia (sensor de 1")	Hamamatsu	A12802-01 / C11440-22CU	Orca FLASH 4.0 V2. Los modelos más nuevos permiten configuraciones de adquisición de imágenes separadas en mitades separadas del sensor, lo que permite la adquisición de imágenes de dos canales en combinación con un divisor de imágenes
Etapa XY motorizada	Märzhäuser	ESCANEO IM 130 x 100	Movimiento de la etapa; la resolución XY de esta etapa es de 0,2 μm por paso
Controlador de escenario XY con joystick	LUDL	MAC6000, joystick XY	Seguimiento manual de gusanos. MAC6000 controlador debe estar conectado a la PC a través del puerto serie (RS-232) configurado a 115200 baudios
Tablero de adquisición digital (DAQ)	Arduino	ONU	Recepción de disparadores TTL de la cámara sCMOS. El Uno debe estar cargado con el paquete Firmata estándar y el puerto USB de la computadora configurado a 57600 baudios
Cable BNC Macho a BNC Macho - 6 pies	Tecnología Hosa	HOBB6	Conectores BNC para disparo TTL
Cable coaxial BNC macho a SMA macho chapado en oro (8,8")	Uxcell	6.08642E+11	Para conectar las salidas de disparo de la cámara de fluorescencia
Adaptador de cabezal giratorio BNC	Hantek	RRBNCTH21	Adaptador de enchufe BNC a banana (4 mm)
Conector BNC hembra a hembra	Diageng	20130530009	Adaptador BNC hembra a hembra para conectar la salida BNC de la cámara al Banana Plug
Cables de puente de placa de prueba flexibles sin soldadura	Z&T	GK1212827	Para conectar las salidas de disparo BNC al DAQ Arduino. Macho a macho.
Estación de trabajo de alto rendimiento	Hp	Z820	Windows 7, 64 GB de RAM, procesador Dual Xeon, unidad C: de estado sólido, puerto serie (RS-232), múltiples ranuras PCIe3 para conectividad Ethernet, tarjetas USB 3.0 y unidades de estado sólido adicionales
Unidad de estado sólido M.2	Samsung (Estados Unidos)	MZ-V5P512BW	Transmisión y análisis de datos de imágenes de alta velocidad
M.2 Adaptador de unidad de estado sólido para estaciones de trabajo	Lycom	DT-120	Adaptador de 4 carriles M.2 a PCIe 3.0
Almacenamiento conectado a la red	Synology	DS-2415+	Almacenamiento y análisis de datos de imágenes
Unidades de disco duro	Occidental Digital	WD80EFZX	RED 8 TB, 5400 RPM Clase SATA 6 Gb/s 128MB Caché 3.5 pulgadas. Almacenamiento de datos de imágenes (redundancia de 10 unidades + 2 unidades)
software
Adquisición de fluorescencia	Hamamatsu	HCImage DIA	Grabación de secuencias de imágenes de fluorescencia de dos canales (GCaMP5 y mCherry) a 20 fps
Adquisición de campo claro	FLIR (anteriormente Point Grey Research)	Captura de moscas	Grabación de secuencias de imágenes JPEG de campo claro
Lector de puerto serie Stage	bonsái	https://bitbucket.org/horizongir/bonsai	Facilita el seguimiento de los gusanos durante el comportamiento
Software del controlador LED	Zeiss	Prueba de Micro Toolbox 2011	Para configurar la intensidad y las entradas de disparo para los diferentes LED de la unidad Colibri.2
ImagenJ	Nih	https://imagej.net/Fiji/Downloads	Revisión sencilla de secuencias de imágenes y cambios de formato para importarlos al software de cuantificación ratiométrica
sobresalir	Microsoft	2002984-001-000001	Para generar subconjuntos de datos de valores separados por comas de Volocity para el análisis de MATLAB
Hallazgo de picos	MATLAB	R2017a	Secuencia de comandos utilizada para los cálculos de entidades de pico de relación
Cuantificación radiométrica	Perkin Elmer	Volocity 6.3	Facilita el cálculo de canales de imagen radiométricos, la segmentación de imágenes para la búsqueda de objetos y la medición de la proporción de objetos encontrados
Scripts
AnalyzeGCaMP_2017.m	MATLAB	Relación media y secuencia de comandos de centroide XY	Analiza una salida radiométrica en formato .csv, consolidando objetos y posiciones de centroide, calculando cambios de relación (ΔR/R), identificando picos y características de pico, y escribiendo gráficos (con y sin picos anotados) en formato postscript. Para la importación de archivos de matriz, el script generará datos en tres carpetas: analizado, picos y seguimientos. La salida 'Analizada' es un archivo de matriz de los objetos consolidados con seis columnas (unidades): tiempo (s), área (micras cuadradas), relación, centroide X (micras), centroide Y (micras) y ΔR/R. La salida 'Picos' es un archivo de matriz de los puntos de tiempo de los picos encontrados, la amplitud (en ΔR/R), el ancho del pico (s), y el protagonismo del pico. La salida de 'trazas' son archivos postscript de trazas de calcio.
XY-etapa-final.bonsai	bonsái	DAQ activado por TTL y lector de puerto serie de posición de etapa	Registra la posición de la platina X e Y (en micras) cuando el Arduino conectado recibe una señal TTL positiva de la cámara sCMOS durante la exposición del fotograma. El script escribe un archivo .csv con cuatro columnas: número de fotograma, posición X (micras), posición Y (micras) y el tiempo transcurrido entre fotogramas (normalmente ~50 ms cuando se graba a 20 fps). La posición de las etapas X e Y de esta salida (columnas 2 y 3, respectivamente) se agrega a las posiciones de los centroides X e Y de AnalyzeGCaM