Registro de las oscilaciones de la banda gamma de las neuronas del núcleo pedunculopontino en un corte de cerebro

Resumen

Fuente: Urbano, F. J., et al. Registro de Oscilaciones de Banda Gamma en Neuronas del Núcleo Pedunculopontino. J. Vis. Exp. (2016).

El video muestra el método para registrar las oscilaciones de la banda gamma en las neuronas PPN. Utilizando una sección sagital del cerebro con bloqueadores sinápticos en el líquido cefalorraquídeo-a, emplea pulsos de corriente positivos a través de una pipeta de parche para abrir los canales de calcio, induciendo una actividad subumbral crucial para la vigilia.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Preparación de líquido cefalorraquídeo artificial estándar (aCSF)

1. Preparación de la solución madre A
   1. Añada 700 ml de agua destilada a un vaso de precipitados limpio de 1 litro antes de añadir productos químicos.
   2. Mientras remueve continuamente un volumen de 500 ml, agregue 136,75 g de NaCl, 6,99 g de KCl, 2,89 g de MgSO₄ y 2,83 g de NaH₂PO₄.
   3. Agregue más agua destilada para alcanzar un volumen final de 1 L. Después de la dilución, la concentración final de cada compuesto es de 117 mM de NaCl, 4,69 mM de KCl, 1,2 mM de_MgSO4 y 1,18 mM de NaH₂PO₄.
   4. Manténgalo refrigerado a 4 °C hasta por 2 semanas.
2. Preparación de la solución madre B
   1. Añade 700 ml de agua destilada a un vaso de precipitados limpio de 1 litro antes de añadir productos químicos.
   2. Mientras se agita continuamente un volumen de 500 ml, añadir 41,45 g de D-glucosa y 41,84 g de NaHCO₃.
   3. Agregue más agua destilada para alcanzar un volumen final de 1 L. Después de la dilución, la concentración final de cada compuesto es de 11,5 mM de D-glucosa y 24,9 mM de NaHCO₃.
   4. Manténgalo refrigerado a 4 °C hasta por 2 semanas.
   5. Antes de cada experimento, mezclar 50 ml de caldo A con 50 ml de caldo B y llevar a 1 L con agua destilada para obtener la concentración final de una solución de LCR y dejar en RT mientras se oxigena continuamente con carbógeno (mezcla de 95%_O2 - 5% de CO₂) durante al menos 30 min. Prepare la concentración final de aCSF solo al comienzo de cada experimento y deséchela al final del día.

>2. Preparación de Sacarosa-Líquido Cefalorraquídeo Artificial (Sacarosa-aCSF)

1. Preparación de la solución madre C
   1. Añada 700 ml de agua destilada a un vaso de precipitados limpio de 1 litro antes de añadir productos químicos.
   2. Mientras remueve continuamente 500 ml de agua destilada, agregue 240 g de sacarosa, 6,55 g de NaHCO₃, 0,671 g de KCl, 4,88 g de MgCl₂, 0,22 g de CaCl₂ y 0,21 g de ácido ascórbico.
   3. Agregue más agua destilada para alcanzar un volumen final de 1 L. Después de la dilución, la concentración final de cada compuesto es 701,1 mM de sacarosa, 78 mM de NaHCO₃, 9 mM de KCl, 24 mM de MgCl₂, 1,5 mM de CaCl₂ y 1,2 mM de ácido ascórbico.
   4. Mantenga la solución madre C a 4 °C durante un máximo de una semana.
   5. Antes de cada experimento, mezclar 300 ml de 50 ml de caldo C con 600 ml de agua destilada para obtener la solución de sacarosa-aCSF en la concentración final. Dejar actuar a temperatura media mientras se oxigena continuamente con carbógeno (mezcla de 95%_O2 - 5% CO₂) durante al menos 30 min.

3. Preparación de la rebanada

1. Coloque un vaso de precipitados limpio con 100 ml de solución de sacarosa-aCSF en hielo mientras lo oxigena con carbógeno y fije el pH en 7,4 con un medidor de pH mientras añade unas gotas de solución de NaOH 0,1 M (cuando el pH < 7,4) o una solución de HCl 0,1 M (cuando el pH > 7,4).
2. Llene una cámara de corte de un vibratomo con sacarosa-aCSF y oxigenérelo. Encienda el sistema de refrigeración a base de glicerol acoplado a la cámara de corte y espere 15 minutos para que se enfríe a 0 - 4 °C.
3. Anestesiar crías de rata (de 9 a 12 años de ratas Sprague-Dawley adultas preñadas cronometradas) con ketamina (70 mg/kg, i.p.; utilizando < volumen final de 50 μl). Cuando el cachorro esté tranquilo, verifique que el reflejo de pellizco de la cola esté ausente.
4. Decapitar cachorros.
   1. Corta la piel de la cabeza longitudinalmente de adelante hacia atrás con una hoja de bisturí de acero al carbono y tira de la piel hacia los lados con pinzas. Corta el hueso que cubre el cerebro, mueve las tijeras lateralmente y retíralo por completo para exponer el cerebro.
   2. A continuación, extraiga rápidamente el cerebro con una espátula (inicialmente colocada debajo del bulbo olfativo para empujarlo suavemente desde las zonas más rostrales hacia las más caudales). Empuje suavemente el cerebro hacia el líquido cefalorraquídeo artificial con sacarosa oxigenado enfriado por hielo (sacarosa-aCSF).
5. Haga un corte parasagital en el hemisferio derecho (eliminando aproximadamente un tercio del hemisferio) y pegue el lado recortado del cerebro en un disco metálico que se fijará magnéticamente a la cámara de corte de un vibroslicador para cortar secciones sagitales de 400 μm que contienen el núcleo pedunculopontino (PPN). Mantenga los cortes de PPN en RT durante 45 minutos antes de las grabaciones de patch-clamp de celda completa.

>4. Grabaciones de oscilaciones de banda gamma en cortes PPN

1. Preparación de solución intracelular de gluconato de potasio (solución de alto K+)
   1. Coloque en hielo un vaso de precipitados limpio con 10 ml de agua destilada. Mientras remueve continuamente, agregue: K+-gluconato, 90,68 mg de fosfocreatina di sal de Tris, 47,66 mg de HEPES, 1,5 mg de EGTA, 40,58 mg de 2⁺-ATP y 4 mg de Na⁺_2-GTP.
   2. Ajuste el pH a 7,3 con KOH (100 mM en agua destilada). Agregue agua destilada hasta alcanzar un volumen final de 20 mL. Si es necesario, ajuste la osmolaridad con sacarosa (100 mM en agua destilada) para que sea de 280 a 290 mOsm. Después de la dilución, la concentración final de cada compuesto es 124 mM de K+-gluconato, 10 mM de fosfocreatina di sal de Tris, 10 mM de HEPES, 0,2 mM de EGTA, 4 mM de Mg²⁺-ATP y 0,3 mM de Na⁺_2-GTP.
   3. Alícuota de soluciones intracelulares en tubos de 1 ml y congelar a -20 °C. Utilizar una alícuota al día y mantener a 4 °C durante los experimentos.
2. Grabaciones de pinzas de parche de celda completa
   1. Colocar las rodajas en una cámara de inmersión y perfundirlas (1,5 ml/min) con aCSF oxigenado (95%_Ø2 - 5% CO₂) que contenga los siguientes antagonistas de los receptores: antagonista selectivo del receptor NMDA, ácido 2-amino-5-fosfonovalérico (APV, 40 μM), antagonista competitivo del receptor de glutamato AMPA/Kainato, 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona (CNQX, 10μM), antagonista del receptor de glicina, estricnina (STR, 10 μM), el antagonista específico del receptor GABA_A gabazina (GBZ, 10 μM) y el bloqueador de los canales de sodio tetrodotoxina (TTX, 3 μM)
      Llene las pipetas de parche de registro (resistencia 2-7 MΩ; fabricadas a partir de capilares de vidrio de borosilicato de pared gruesa normales disponibles en el mercado de 1,0 mm de diámetro exterior y 0,6 mm de diámetro interior) con una solución intracelular de alto K+ utilizando rellenos de pipetas de parche disponibles en el mercado con un filtro de solución. Inserte la pipeta en el soporte del amplificador. Aplique una pequeña presión positiva con una jeringa de 1 ml conectada al soporte de la pipeta mediante un tubo de silicona conectado a una válvula de tres vías. Conecte la parte posterior del soporte de pipeta a un amplificador de pinza de parche.
   2. Mueva la pipeta de registro utilizando un micromanipulador mecánico cerca del núcleo PPN utilizando un objetivo 4X combinado con la óptica de contraste de interferencia diferencial del infrarrojo cercano.
      nota: El núcleo de PPN se puede observar en cortes dorsales al pedúnculo cerebeloso superior (SCP; observable como un haz grueso de axones). Las pipetas de registro se localizaron en la PPN pars compacta, que se localiza inmediatamente dorsal al extremo posterior del pedúnculo.
   3. Ponga la pipeta de grabación en contacto con una neurona PPN mientras se visualiza con una lente de inmersión en agua de 40X y aplique rápidamente una succión negativa para formar un sello con la célula.
   4. Utilice el software de sellado de abrazadera de voltaje para monitorear la resistencia de la pipeta durante la succión negativa utilizando el protocolo del fabricante.
      1. Cuando la succión negativa aumenta lentamente y los valores de resistencia leídos por el monitor de pinza de parche en la punta de la pipeta alcanzan los 80 - 100 MOhm, cambie rápidamente el potencial de retención a -50 mV y libere la presión negativa. Comienza a aplicar continuamente la succión negativa hasta que se rompe la membrana de la neurona y se logra el acceso eléctrico en la configuración de la célula completa.
      2. Si los valores de resistencia de acceso medidos por el software del sello de abrazadera de voltaje son de 10 MOhm o más, continúe aplicando succión negativa en cantidades más pequeñas.
   5. Compense la capacitancia (es decir, los transitorios lentos y rápidos observados después de romper la membrana de la celda) y la resistencia en serie en modo de pinza de voltaje. Cambie el modo de grabación a la pinza amperimétrica y compense rápidamente los valores del puente (por ejemplo, mueva la perilla del amplificador o haga clic en el menú de compensación automática con el mouse de la computadora).
      1. Monitoree continuamente el potencial de membrana en reposo de la neurona PPN que se registra utilizando el protocolo del fabricante. Si el potencial de membrana en reposo cambia hacia valores despolarizantes o hiperpolarizantes, utilice pequeñas cantidades de corriente continua (hasta 100 pA) para mantener el valor final óptimo de -50 mV.
         nota: Mantenga solo las neuronas PPN con un potencial de membrana en reposo (RMP) estable de -48 mV o más hiperpolarizadas (es decir, RMP < -48 mV).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
sacarosa	Sigma-Aldrich	S8501	C12H22O11, peso molecular = 342.30
Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich	S6014	NaHCO3, peso molecular = 84,01
Cloruro de potasio	Sigma-Aldrich	P3911	KCl, peso molecular = 74.55
Cloruro de magnesio hexahidratado	Sigma-Aldrich	M9272	MgCl2 · 6H2O, peso molecular = 203.30
Cloruro de calcio dihidratado	Sigma-Aldrich	C3881	CaCl2 · 2H2O, peso molecular =147.02
D-(+)-Glucosa	Sigma-Aldrich	G5767	C6H12O6, peso molecular = 180,16
Ácido L-ascórbico	Sigma-Aldrich	A5960	C6H8O6, peso molecular =176.12
cloruro de sodio	Acros Organics	327300025	NaCl, peso molecular = 58,44
Gluconato de potasio	Sigma-Aldrich	G4500	C6H11KO7, peso molecular = 234,25
Sal de fosfocreatina di(tris)	Sigma-Aldrich	Año 1937	C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, peso molecular = 453.38
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	C8H18N2O4S, peso molecular = 238,30
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	[-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, peso molecular = 380.40
Sal de magnesio de adenosina 5'-trifosfato	Sigma-Aldrich	A9187	C10H16N5O13P3 · xMg2+, peso molecular = 507,18
Guanosina 5'-trifosfato hidrato de sal sódica	Sigma-Aldrich	G8877	C10H16N5O14P3 · xNa+, peso molecular = 523,18
Citrato de tetrodotoxina	Laboratorios Alomone	T-550	C11H17N3O8, peso molecular = 319.27
Ácido DL-2-amino-5-fosfonovalérico	Sigma-Aldrich	A5282	C5H12NO5P, peso molecular = 197,13
CNQX hidrato de sal disódica	Sigma-Aldrich	C239	C9H2N4Na2O4 · xH2O, peso molecular = 276.12
estricnina	Sigma-Aldrich	S0532	C21H22N2O2, peso molecular = 334,41
Clorhidrato de mecamilamina	Sigma-Aldrich	M9020	C11H21N · HCl, peso molecular = 203.75
Gabazina (SR-95531)	Sigma-Aldrich	S106	C15H18BrN3O3, peso molecular = 368.23
Clorhidrato de ketamina	Mylan	67457-001-00
microscopio	Nikon	Eclipse E600FN
Micromanipulador	Instrumentos Sutter	ROE-200
Micromanipulador	Instrumentos Sutter	MPC-200
amplificador	Dispositivos moleculares	Multiclamp 700B
Convertidor A/D	Dispositivos moleculares	Digidata 1440A
calentador	Instrumentos Warner	TC-324B
bomba	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
Cartucho de bomba	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
Extractor de pipetas	Instrumentos Sutter	P-97
cámara	Q-Imágenes	RET-200R-F-M-12-C
Vibratomo	Leica Biosystems	Leica VT1200 S
Sistema de refrigeración	Instrumentos Vibratome	900R
equipo
microscopio	Nikon	Eclipse E600FN
Micromanipulador	Instrumentos Sutter	ROE-200
Micromanipulador	Instrumentos Sutter	MPC-200
amplificador	Dispositivos moleculares	Multiclamp 700B
Convertidor A/D	Dispositivos moleculares	Digidata 1440A
calentador	Instrumentos Warner	TC-324B
bomba	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
cartucho de bomba	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
extractor de pipetas	Instrumentos Sutter	P-97
cámara	Q-Imágenes	RET-200R-F-M-12-C