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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Fabricación de auriculares con dos electrodos bipolares (Figura 1)
- Corte 3,5 cm de alambre de acero inoxidable recubierto de politetrafluoroetileno.
- Pele aproximadamente 1 mm de la capa aislante del cable en ambos extremos. No tenga demasiado alambre pelado.
- Coloque dos alfileres en un soporte de tornillo de banco con la parte inferior del pasador que tiene una ranura más larga hacia abajo.
- Aplique fundente en los extremos pelados del alambre y en la parte superior de los alfileres.
- Estaña la parte pelada del alambre con la soldadura suficiente para recubrirlo.
- Agregue una cantidad mínima de soldadura a la parte superior del pin sin desbordarse hacia los lados.
- Coloque un extremo de los extremos pelados del cable en el pin tan profundo como lo permita mientras se derrite la soldadura.
nota: Hay un orificio lateral por donde puede salir el cable, no deje que el cable se salga del pasador. Todo el cable pelado debe permanecer dentro de la clavija.
- Repita los pasos 1.6-1.7 para el segundo pin, ahora con los otros extremos pelados del cable.
- Deje reposar las clavijas durante 30 segundos para que se asienten, retírelas del soporte del tornillo de banco y luego tire de ellas para asegurarse de que la conexión entre el cable y las clavijas sea fuerte y se mantenga.
- Enjuague los alfileres con agua fría y luego séquelos.
- Verifique la conductancia entre el pin 1 y el pin 2 usando un ohmímetro.
- Junta los alfileres de los extremos del alambre y mantenlos paralelos y cerca. Sujeta un hemostático al centro del alambre. Luego, gire el hemostático, de modo que el alambre se enrolle alrededor de sí mismo bastante apretado. Retire el hemostático.
- Sujete una pinza en el alambre retorcido 2 mm por debajo de los pasadores y doble el alambre a 90°.
- Vuelva a empujar el mismo alambre 90° hacia atrás sobre las pinzas creando otra curva de 1 mm desde la primera.
- Corta el alambre retorcido en un ángulo de 45° por debajo de la curva a 3,5 mm con unas tijeras pequeñas y afiladas.
- Prepare dos de estos electrodos bipolares (trenzados de doble clavija) para cada auricular (opcional, el segundo es de respaldo en caso de problemas eléctricos con el primero).
- Prepare un solo electrodo de referencia cortando un alambre con clavijas soldadas en ambos extremos en dos (pasos 1.1-1.17, Figura 1A).
- Corta el alambre a 7 mm.
- Dobla el extremo 1 mm por debajo de la punta.
- Luego, cubra la punta doblada de 1 mm del alambre con pinzas y gire el alambre firmemente alrededor de las pinzas para crear un pequeño bucle (1 mm de diámetro).
- Dobla el lazo perpendicular a la parte recta del alambre para que la punta del alambre vuelva a apuntar hacia afuera.
- Ensamble los dos electrodos bipolares y el electrodo de referencia único en el pedestal de seis pines de manera que los electrodos bipolares estén uno al lado del otro con una distancia de 6 mm entre ellos, y que el electrodo de referencia se coloque en el orificio exterior central (Figura 1B).
nota: Un método alternativo es implantar los electrodos, cementarlos en su lugar y luego insertar sus clavijas en el pedestal.
>2. Implante de electrodos estereotáxicos
- Esterilice todas las herramientas quirúrgicas y el conjunto de electrodos de seis clavijas mediante autoclave antes de la cirugía. Se debe mantener un campo quirúrgico estéril durante la cirugía y se deben usar guantes quirúrgicos estériles. Se recomiendan paños estériles (p. ej., Press n' Seal) para cubrir al animal, excepto para el área quirúrgica.
- Utilice ratones VGAT-Cre de 8 semanas de edad (que expresan Cre recombinasa bajo el control del gen transportador vesicular de GABA [VGAT], emparejados por edad, tanto machos como hembras) para cirugías 4 semanas después del destete. Registre el peso del animal antes de la cirugía para permitir la medición de la pérdida de peso postquirúrgica.
- Utilice un vaporizador de isoflurano certificado o un sistema de anestesia de bajo flujo equipado con una bomba de jeringa de precisión, un vaporizador digital integrado y una almohadilla térmica de retroalimentación.
nota: Los sistemas de bajo flujo son capaces de administrar anestesia a tasas de flujo bajas proporcionales al tamaño del animal en una cámara de inducción o a través de un cono nasal en el marco estereotáxico (70 mL/min, la concentración de isoflurano en el aire es del 4% para la inducción y del 2% para la cirugía). Usar menos anestesia no solo beneficia al animal durante las cirugías, sino que también reduce el riesgo de exposición del personal del laboratorio al isoflurano.
- Coloque el animal anestesiado sobre una almohadilla térmica calentada a 37 °C para mantenerlo caliente durante la cirugía. Si utiliza un sistema de temperatura controlada por retroalimentación, inserte la sonda de temperatura ligeramente lubricada en el recto del animal para controlar la temperatura durante la cirugía.
- Monte al animal en el marco estereotáxico colocando suavemente las barras de la oreja en las orejas y los dientes superiores frontales en la barra de incisivos. Coloque el cono de la nariz sobre la nariz para una administración adecuada de la anestesia. Asegúrese de que la cabeza esté nivelada y centrada y que no se pueda mover cuando se palpa ligeramente.
- Inyecte por vía subcutánea 0,5 mL de normosol para la hidratación.
- Aplique lubricante ocular para prevenir la sequedad de la córnea.
- Controle la profundidad de la anestesia por la ausencia del reflejo de retirada después de pellizcar un dedo del pie de una extremidad posterior, y luego disminuya el isoflurano a 1.5%-2.0% durante la cirugía.
- Eliminar el vello en y alrededor de la zona quirúrgica mediante depilación o uso de maquinillas (afeitado) o crema depilatoria y desinfectar la piel con tres ciclos de aplicación alterna de yodo y etanol, terminando con yodo. Se recomienda eliminar el vello lejos del sitio quirúrgico solo si hay medios para mantener la anestesia en ese lugar. Si es necesario, use aplicadores de punta de algodón bañados en alcohol para eliminar el vello del área inmediata que rodea la cabeza. Inyectar 0,05 mL del analgésico local bupivacaína (0,25%) por vía subcutánea.
- Haga una incisión en el cráneo con un bisturí y luego corte una parte de la piel con unas tijeras quirúrgicas afiladas, exponiendo el cráneo. Empujando la piel hacia un lado, con un hisopo de algodón, limpie el cráneo de todos los músculos y tejidos subyacentes que obstruyen la vista.
nota: Para detener el sangrado accidental, aplique presión sobre el sitio del sangrado con un hisopo de algodón estéril hasta que se detenga.
- Limpie el cráneo con peróxido de hidrógeno usando hisopos de algodón estériles para hacer visibles las suturas del cráneo y tanto el bregma como la lambda.
- Seque bien el cráneo y luego aplique una gota de adhesivo dental autograbante con su aplicador. Cepíllelo en el cráneo, espere 60 segundos y cure con una luz ultravioleta dental durante 40 segundos. Una superficie brillante indica que el adhesivo ha sido efectivamente reticulado con el cráneo.
nota: Este paso es fundamental para la fijación segura de los auriculares.
- Utilice una broca de 0,031" (0,79 mm) para perforar dos orificios bilateralmente para la implantación de electrodos de profundidad del hipocampo (aproximadamente 5.000 rpm). Taladre un orificio de fresa adicional para el electrodo de referencia por encima del cerebelo detrás de la lambda.
NOTA: Al perforar, tenga cuidado de bajar el taladro lentamente y evite perforar el cerebro.
- Las coordenadas de los electrodos son las siguientes (de bregma en mm): electrodos del hipocampo a 3 mm posterior, 3 mm lateral y 3 mm de profundidad; y electrodo cerebeloso de referencia a 6 mm posterior, 0 mm lateral y 0 mm de profundidad (subdural).
- Para aumentar la precisión, use un taladro montado estereotáxicamente, ponga a cero el eje X / Y del manipulador estereotáxico al tocar bregma: este es el punto de referencia para las coordenadas.
- Ensamble un auricular insertando todos los electrodos en el pedestal de seis pines, asegurándose de que las pines estén completamente empujadas hacia el pedestal. Monte el pedestal en el portaelectrodos en un marco estereotáxico (Figura 1B).
- Alinee los electrodos por encima de los orificios de rebaba correspondientes. Implante estereotáxicamente electrodos de alambre bipolar retorcido de acero inoxidable en el hipocampo derecho e izquierdo y electrodo de referencia en el cerebelo bajando lentamente el auricular y guiando los electrodos hacia los orificios de rebaba.
- Cuando el electrodo de torsión del hipocampo esté justo encima del orificio, ponga a cero el eje Z y baje lentamente a -3,0 mm.
- Cubra la superficie del cráneo y los electrodos con cemento dental y rellene el espacio entre la superficie del cráneo y la parte inferior del pedestal. Los bordes de la piel estarán adyacentes al cemento dental de modo que no quede expuesto ningún tejido subyacente. Espera a que el cemento se seque y se endurezca. A continuación, separe el soporte de electrodos del brazo estereotáxico y retire el soporte del pedestal.
- Inyectar 0,1 mL de ketoprofeno (1 mg/mL, por vía subcutánea [SC]) para la analgesia y una segunda dosis de 0,5 mL de normosol (SC) para la hidratación y retirar al animal del marco estereotáxico.
- Coloque una almohadilla isotérmica precalentada a 37 °C dentro de una jaula de vivero vacía cubierta con una toalla de papel. Una vez que esté completamente despierto, coloque al animal en una jaula limpia con ropa de cama y comida blanda, y devuélvalo al vivero. A partir de este punto, los animales se alojan solos para evitar que se muerdan los auriculares unos a otros. Las tolvas de barra de alambre no se usan para evitar que los auriculares se atasquen y, en cambio, las botellas de agua están atadas a la parte inferior de la parte superior de la jaula y la comida está presente en la ropa de cama.
- Alimente al animal con un alimento blando durante 72 horas después de la cirugía y controle la pérdida de peso y la puntuación de la condición corporal. Los animales deshidratados pueden recibir 0,5 ml de normosol por vía subcutánea si están deshidratados (pérdida de peso, aumento de la turgencia de la piel, ojos hundidos). El ketoprofeno se puede administrar por vía subcutánea una vez al día durante 2 días más después de la cirugía (siga el régimen de analgesia de acuerdo con las pautas del comité institucional local de cuidado y uso de animales [IACUC]). Permitir que los animales se recuperen completamente en sus jaulas durante 4-7 días antes de ser transferidos al sistema de registro de electroencefalografía (EEG).
