Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Preparación de la solución experimental y el equipo para el registro de matrices de electrodos múltiples
- Prepare líquido cefalorraquídeo artificial (líquido cefalorraquídeo artificial [aCSF]; 124 mM de NaCl, 4,4 mM de KCl, 1 mM de NaH2PO3, 2 mM de MgSO4, 2 mM de CaCl2, 25 mM de NaHCO3 y 10 mM de glucosa, burbujeados con 95% deO2 y 5% de CO2).
- Utilice dos tipos de sondas MEA: MEA plana de 6 x 10 y MEA de 8 x 8. La primera sonda cubre la región que comprende la corteza, el cuerpo estriado y el tálamo. Esta última sonda cubre solo la región cortical.
- Utilice un amplificador de 60 canales con un filtro de paso de banda establecido entre 0,1 Hz y 3 kHz con una amplificación de 1.200. Adquiera datos a una frecuencia de muestreo de 10 kHz.
- Coloque dos alambres de plata recubiertos de AgCl dentro de la cámara MEA para DCS. Utilice los cables de plata recubiertos de AgCl para producir campos eléctricos generados por un estimulador aislado.
- Coloque un electrodo de tungsteno (diámetro, 127 μm; longitud, 7,62 cm; punta cónica de 8° AC; resistencia, 5 MΩ) para la estimulación talámica, y coloque el electrodo de referencia en la cámara MEA. Suministre las corrientes del electrodo de tungsteno utilizando un estimulador aislado que está controlado por un generador de pulsos.
>2. Preparación de la rebanada de cerebro
- Utilice ratones machos C57BL/6J, de 4 a 8 semanas de edad. Aloje a los animales en una habitación con aire acondicionado (21-23 °C; 50% de humedad; ciclo de luz/oscuridad de 12 horas/12 horas, las luces se encienden a las 8:00 a.m.) con acceso gratuito a comida y agua.
- Tome una alícuota de 250 ml del aCSF que se preparó en el paso 1.1 y colóquela en un vaso de precipitados que contenga hielo. Al mismo tiempo, suministre gas continuo que esté compuesto por un 95% deO2 y un 5% de CO2.
- cirugía
- Anestesiar al animal con isoflurano al 4% en una caja de vidrio durante aproximadamente 3 min. Una vez que el animal alcance una profundidad quirúrgica de anestesia (indicada por la falta de respuesta al pinzamiento del dedo del pie), colóquelo en una bandeja poco profunda que esté llena de hielo picado y retire la cabeza con unas tijeras.
- Exponga el cráneo y recorte el músculo restante. A continuación, con rongeurs, retire la superficie dorsal del cráneo del cerebro. Recorta los lados del cráneo con rongeurs. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos con una solución de etanol al 75%.
- Con una espátula, corte los bulbos olfativos y las conexiones nerviosas a lo largo de la superficie ventral del cerebro y extraiga el cerebro. Después de la decapitación, transfiera rápidamente el cerebro a un vaso de precipitados lleno de aCSF oxigenado helado.
- Preparación de MT-ACC Brain Slice
nota: Prepare segmentos que contengan la ruta desde el MT hasta el ACC.
- Cortar a mano el bloque cerebral con dos cortes sagitales de 2,0 mm laterales a la línea media en cada hemisferio para mostrar la anatomía subcortical. A continuación, haz dos cortes en ángulo. Realice el primer corte transversal paralelo al tracto de fibras visible en el cuerpo estriado.
- Realice el segundo corte transversal desde la conexión entre el cerebelo y la corteza visual hasta el punto medio entre la comisura anterior y el tracto óptico que son ventrales y paralelos a la vía talamoquingulada.
- Fije el bloque cerebral a una placa angular (~ 120 °) con adhesivo de cianoacrilato y haga un corte justo por encima del punto de inflexión de la vía. Despliega la placa, aplánala y pégala en la etapa de la cámara de un vibrátomo.
- Haga cortes de cerebro del tálamo-ACC medial (500 μm de grosor) y luego sumérjalos en aCSF oxigenado helado. Transfiera los cortes a la cámara de registro y manténgalos a 32 °C en perfusión continua (12 ml/min) con aCSF oxigenado durante 1 hora.
>3. Preparación de la cámara de perfusión para el registro de matrices de electrodos múltiples
- Preparación de la cámara de perfusión
- Coloque una sonda MEA en un sistema multicanal y use dos tubos de polietileno separados para conectar la sonda a una bomba peristáltica. Use un tubo para guiar el aCSF hacia la cámara MEA y el otro tubo para guiar el aCSF fuera de la cámara. Por último, perfundir continuamente el preparado con aCSF oxigenado tibio (29-30 °C) (8 ml/min).
- Transfiera el corte de cerebro a MEA. Sostenga el corte de cerebro en el MEA con un hisopo de algodón húmedo. Mueva con cuidado el corte de cerebro para asegurarse de que el ACC esté orientado por encima de los electrodos.
- Use kits de anclaje de corte y sujeciones para presionar el corte de cerebro. Este paso asegura una buena conexión eléctrica entre el corte y los electrodos.
>4. Generación de campos eléctricos por DCS
>Nota: La definición de la orientación del campo eléctrico se basó en la dirección del eje axodendrítico en el ACC. Las orientaciones de los compartimentos de dendritas y somas se confirmaron mediante tinción de Golgi.
- Coloque el electrodo de AgCl (definido como el ánodo) proximal al ACC y coloque el otro electrodo (definido como el cátodo) distal al ACC. Registre la intensidad de campo que es generada por las dos orientaciones de campo (paralela y perpendicular a las fibras axodendríticas del ACC) por el MEA, y entregue las corrientes de los campos eléctricos utilizando un estimulador.
- Fije la distancia de los electrodos de AgCl (aproximadamente 1,5-2 cm) y ajuste la intensidad de corriente del estimulador para que el DCS esté entre 0,5 y 2 mA.
>5. Respuestas sinápticas corticales inducidas eléctricamente
>Nota: Inducir respuestas sinápticas en el ACC mediante estimulación eléctrica en el MT, en el que un generador de estímulo eléctrico programable produce pulsos de corriente bifásicos rectangulares.
- Repita la sección 3 anterior.
- Coloque un electrodo de tungsteno en el MT y administre pulsos desde el estimulador a la región talámica de las rodajas a través de electrodos de tungsteno bipolares.
- Utilice varias intensidades de corriente para determinar el umbral que provoca una respuesta ACC. En este caso, utilice una intensidad de ±150 μA y una duración de 200 μseg, lo que provocó una respuesta máxima del 80% en el ACC en la mayoría de los cortes.
- Mueva el electrodo de tungsteno a lo largo de la vía del talamocingulado (desde el MT hasta el cuerpo calloso) en el corte MT-ACC para obtener los perfiles de respuesta óptimos.
- Realice de 10 a 20 barridos de las respuestas de ACC y utilice el software para promediar automáticamente todos los ACC evocados por la estimulación de MT. El resultado son las respuestas sinápticas en ACC inducidas por la estimulación de MT por la vía MT-ACC.
>6. Actividad similar a una convulsión inducida eléctricamente
>Nota: La actividad similar a las convulsiones fue inducida por la aplicación de 4-aminopiridina (4-AP; 250 μM) y bicucullina (5 μM). Estudios previos de control de tiempo mostraron que las respuestas máximas y estables aparecieron 2-3 horas después de la aplicación del fármaco.
- Repita la sección 5 anterior.
- Agregue medicamentos a la solución de perfusión. Utilice 4-AP (250 μM) y bicucullina (5 μM). Mezcle los medicamentos uniformemente y continúe la perfusión durante 2-3 horas.
- Para facilitar la actividad similar a las convulsiones, mantenga la bomba de perfusión a una velocidad de perfusión relativamente rápida (8 ml/min), lo que también puede ayudar a prevenir la acumulación de un gradiente de pH.
- Coloque un electrodo de tungsteno en el MT y administre estimulación eléctrica (150 μA, 200 μseg de duración) para obtener perfiles de respuesta ACC.
- Haz de 10 a 20 barridos y promedia las respuestas.
- Reemplace la solución de perfusión con aCSF fresco para lavar los medicamentos. Repita el paso 6.5.
>7. Probando el efecto de la EDC en las respuestas corticales evocadas
- Repita las secciones 3 y 4. Asegúrese de que se generen campos eléctricos uniformes al pasar corrientes entre dos cables de plata recubiertos de AgCl paralelos que se colocan dentro de la cámara MEA. Si no hay problemas, el DCS se mantiene entre 0,5 y 2 mA.
- Apague el DCS y coloque un electrodo de tungsteno para estimular el tálamo (±150 μA, 200 μseg de duración). Para obtener las respuestas sinápticas máximas en el ACC, realice de 10 a 20 barridos y promedie las respuestas.
- Encienda simultáneamente la estimulación DCS (2 mV/mm DCS) y la estimulación talámica (350 μA, 200 μseg de duración). Evaluar los cambios de amplitud de la respuesta ACC evocada por la estimulación talámica durante la EDC.
- Apague el DCS y agregue 4-AP (250 μM) y bicucullina (5 μM) a la solución de perfusión. Luego espere 2-3 horas. Cuando los fármacos afectan al corte del cerebro, el corte produce respuestas convulsivas corticales.
- Realice de 10 a 20 barridos de las respuestas de ACC y luego mida la amplitud y la duración de las respuestas de convulsiones corticales evocadas eléctricamente.
- Después del paso 7.5, active simultáneamente el DCS (2 mV/mm de intensidad de DCS) y la estimulación talámica (150 μA, 200 μseg de duración). Evaluar los cambios en la amplitud y duración de las respuestas convulsivas corticales evocadas durante la aplicación de EDC.
- Reemplace la solución de perfusión con aCSF fresco para lavar los medicamentos y repita los pasos 7.2 y 7.3.
- Recopile todos los datos de registro y agrupe los datos en las diferentes condiciones experimentales. Evaluar la amplitud y duración de las respuestas a las convulsiones corticales en diferentes condiciones experimentales.
