Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Preparación y cultivo de cortes organotípicos del hipocampo
NOTA: Este protocolo permite la producción de cortes organotípicos del hipocampo. Idealmente, no se deben sacrificar y diseccionar más de tres animales en una sesión para garantizar que cada paso se realice rápidamente y para evitar comprometer la calidad de las rebanadas. Utilice una técnica aséptica en todo momento.
- Asegúrese de seguir los siguientes pasos antes de iniciar el protocolo de disección.
- Prepare y filtre: esterilice todas las soluciones con anticipación con un filtro de 0,22 μm.
- Mantenga las soluciones a 4 °C durante el almacenamiento y durante la disección del cerebro y la preparación del corte del hipocampo manteniendo los recipientes de almacenamiento y las placas de Petri en un disipador de calor de metal sobre hielo húmedo en todo momento.
- Autoclave todos los instrumentos metálicos, anillos y pañuelos de papel.
- Asegúrese de que todos los instrumentos y materiales que se utilizarán para cada paso del protocolo estén listos para usar, dispuestos con anticipación y rociados con etanol al 70%. Luego, deja que se enfríen y se sequen.
- Sacrificar a una cría de ratón C57BL/6N de 5 a 7 días de edad por dislocación cervical y limpiar brevemente toda la superficie de la piel con papel tisú estéril empapado en etanol al 70%. Seca la piel con palmaditas y decapita al cachorro con unas tijeras de mayonesa.
- Corta la piel del cuero cabelludo con unas tijeras de iris a lo largo de la línea media de la cabeza, comenzando en la región occipital y terminando cerca del hocico, y retírala lateralmente.
- Inserte la punta de las tijeras Vannas en el foramen magnum y haga dos pequeños cortes laterales en el hueso a lo largo de los senos paranasales transversales, luego corte el cráneo a lo largo de la línea media hasta el bulbo olfatorio y haga dos pequeños cortes perpendiculares a la línea media en esta región.
- Con pinzas curvas de punta fina, retraiga los colgajos de hueso lateralmente lejos de la línea media. Extraiga con cuidado el cerebro con una espátula pequeña y transfiéralo a una placa de Petri recubierta de elastómero de silicona de 90 mm que contiene un "medio de disección"
nota: El medio de disección es la solución salina equilibrada de Gey (5 mg/mL de D-glucosa, 1% de solución antibiótica-antimicótica, 10.000 unidades/mL de penicilina, 10 mg/mL de estreptomicina y 25 μg/mL de anfotericina B).
- Retire el cerebelo y separe los hemisferios cerebrales a lo largo de la línea media con una cuchilla de afeitar. Use una espátula para transferir los hemisferios cerebrales a una nueva placa de Petri recubierta de elastómero de silicona de 90 mm llena de medio de disección fresco y helado. Si se va a utilizar más de un animal en una sesión, repita los pasos 1.2 a 1.6.
- Bajo un microscopio estereoscópico, corte el bulbo olfatorio y la punta de la corteza frontal con una cuchilla de afeitar y separe la corteza cerebral del resto del tejido cerebral con pinzas de punta fina. Este paso deja el hipocampo expuesto en la superficie medial del tejido cortical. A partir de este paso, utilice una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar (esterilizada con ultravioleta y limpia con una solución de etanol al 70%).
- Aplique medio de disección helado a un disco de corte de plástico plano y, con una espátula, coloque el tejido cerebral en el disco de manera que la superficie medial de la corteza quede hacia arriba y el eje del hipocampo sea perpendicular al eje de la cuchilla de corte.
- Retire el medio de disección del disco de corte tanto como sea posible con una pipeta Pasteur de punta fina.
- Corte el cerebro en rodajas de 400 μm con un picador de pañuelos a una velocidad y fuerza de corte del 50%.
nota: Este paso debe completarse lo más rápido posible, ya que el tejido cerebral no está sumergido en el medio de disección.
- Reemplace el medio de disección en la placa de Petri recubierta de elastómero de silicona con el medio fresco helado.
- Una vez terminado el picador de tejidos, sumerja con cuidado el tejido cerebral en un medio de disección nuevo y transfiera el tejido cortado a la placa de Petri recubierta de elastómero de silicona de 90 mm con un bisturí de hoja recta.
- Bajo un microscopio estereoscópico, separe cuidadosamente las rodajas corticales con pinzas de punta fina. Para cada corte, inspeccione el hipocampo para determinar la morfología y el posible daño tisular resultante de la disección o el corte.
- Separe el hipocampo de la corteza entorrinal y de la fimbria con pinzas de punta fina y tijeras Vannas pequeñas. Por lo general, se generan alrededor de 6 a 8 cortes de hipocampo por hemisferio.
- Transfiera hasta 6 rodajas de hipocampo a un inserto de cultivo de tejidos con una pipeta Pasteur cortada y colóquela dentro de una placa de Petri de 35 mm. Asegúrese de que las rebanadas estén separadas por unos milímetros (esto asegurará que cada rebanada se pueda visualizar individualmente).
- Agregue inmediatamente un "medio de crecimiento" helado en la parte inferior de cada placa de Petri, debajo del inserto de cultivo de tejidos, justo debajo de la parte superior del borde del inserto de cultivo de tejidos.
nota: El medio de crecimiento contiene 50% de medio esencial mínimo Eagle, 25% de solución salina equilibrada de Hanks, 25% de suero de caballo, 5 mg/mL de D-glucosa, 2 mmol/L de L-glutamina, 1% de solución antibiótica-antimicótica y 10 mmol/L de ácido HEPES(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinenetanosulfónico), titulado a pH 7,2 con hidróxido de sodio.
- Cambie el medio de crecimiento el día después de la disección y cada 2 a 3 días después (use el medio de crecimiento a 37 °C). Asegúrese de que el medio de crecimiento se agregue lo suficiente, pero no tanto como para que se desborde sobre la membrana del inserto de cultivo de tejidos, lo que podría comprometer la viabilidad de las cortes de tejido.
- Antes de ser utilizados en experimentos, mantenga los cortes de tejido en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de dióxido de carbono en el aire durante 12 a 14 días.
>2. Preparación de los cortes organotípicos del hipocampo para el protocolo experimental de TBI de voladura
NOTA: Los pasos de esta sección, excepto la obtención de imágenes, se llevan a cabo en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar.
- Inserte los anillos de acero inoxidable hechos a medida en una placa de 6 pocillos (uno por pocillo).
NOTAS: Los anillos tienen un borde con una muesca (que debe colocarse en la posición de las 12 en punto) y encajan perfectamente dentro de los pocillos, mientras que los insertos de cultivo de tejidos encajan fácilmente en este borde. Asegúrese de que los anillos se laven con un desinfectante bactericida, se enjuaguen a fondo con agua purificada, se autoclave y se dejen enfriar con anticipación.
- Llene el pocillo de la placa de 6 pocillos con un "medio experimental" sin suero precalentado (37 °C) con yoduro de propidio.
nota: El medio experimental con yoduro de propidio es 75% Medio esencial mínimo Eagle, 25% solución salina balanceada de Hanks, 5 mg/mL de D-glucosa, 2 mmol/L de L-glutamina, 1% de solución antibiótica-antimicótica, 10 mmol/L HEPES y 4,5 μmol/L de yoduro de propidio, pH titulado a 7,2 con hidróxido de sodio.
- Asegúrese de que el nivel medio no llegue por encima de la muesca del anillo. Transfiera la placa de 6 pocillos con los anillos a la incubadora durante 1 h para asegurarse de que el medio esté a 37 °C inmediatamente antes de transferir los insertos de cultivo de tejidos.
- Transfiera los insertos de cultivo de tejidos con las cortes organotípicas de las placas de Petri de 35 mm a la placa de 6 pocillos con los anillos y el medio experimental con pinzas.
- Haga un punto en el borde de la plaquita en la posición de las 3 en punto con un rotulador permanente.
nota: Los insertos se retirarán de la placa de 6 pocillos durante el experimento. Este paso facilita el retorno del inserto a su posición original después de la exposición a la onda de choque y realiza fácilmente un seguimiento de cada corte en todo el protocolo.
- Etiquete cada placa de 6 pocillos con un nombre y una fecha únicos y haga un mapa de los pocillos de cada placa, nombrando cada pocillo (por ejemplo, A, B, C, etc.) y cada rebanada en cada pocillo (por ejemplo, 1, 2, 3, etc.), de modo que cada rebanada tenga un identificador único (por ejemplo, A1, A2, A3, etc.).
- Transfiera la placa de 6 pocillos a la incubadora durante 1 h inmediatamente antes de tomar imágenes para asegurarse de que las rodajas estén a 37 °C.
nota: Evite el desbordamiento del medio o las burbujas de aire debajo de la membrana del inserto de cultivo de tejidos, lo que podría comprometer la viabilidad de las rodajas.
- 1 h después de la transferencia al medio experimental, se tomarán imágenes de cada corte individualmente utilizando un microscopio de fluorescencia (objetivo 2X, NA 0.06) equipado con un filtro de excitación (BP 535/50 nm) y emisión (LP 610 nm) adecuado para evaluar la salud del corte antes de llevar a cabo el protocolo de lesión.
Notas: Se debe considerar que los cortes que exhiben áreas de tinción roja densa en esta etapa presentan una viabilidad comprometida y deben excluirse de análisis posteriores (estos generalmente representan menos del 10% del número total de cortes generados). Asegúrese de que las imágenes se realicen de forma secuencial y lo más rápido posible para minimizar el tiempo que las rebanadas están fuera de la incubadora (por lo general, la imagen de 6 pocillos debería tardar poco menos de 30 minutos).
- Mantenga la tapa de la placa de 6 pocillos puesta en todo momento. Es posible que se acumule algo de condensación en el interior de la tapa. Si esto sucede, use brevemente un secador de pelo en la configuración baja.
- Asegúrese de que todas las condiciones de imagen sean idénticas en diferentes días y entre experimentos.
nota: El objetivo de las imágenes es cuantificar la fluorescencia de los tejidos; Por lo tanto, este paso es importante para garantizar la reproducibilidad de los resultados y permitir la comparación de los datos.
>3. Inmersión y transporte de los insertos de cultivo de tejidos con las cortes organotípicas del hipocampo
- Inmediatamente después de la obtención de imágenes, en una campana de flujo laminar, se extrae un cultivo de tejido de la placa de 6 pocillos con pinzas.
- Transfiera con cuidado el inserto a una bolsa de polietileno estéril (3" x 5") precargada con 20 mL de medio experimental tibio (37 °C) recién burbujeado con 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono.
nota: Asegúrese de que el medio experimental enriquecido con oxígeno y dióxido de carbono se burbujeó durante al menos 40 minutos con un 95 % de oxígeno y un 5 % de dióxido de carbono utilizando un burbujeador de vidrio sinterizado dentro de un frasco Dreschel y se transfirió a las bolsas de polietileno estériles dentro de una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar utilizando una jeringa de 20 ml con un filtro bacteriano y un tubo de llenado estéril (127 mm) conectado. Selle las bolsas inmediatamente y transfiéralas a una incubadora a 37 °C durante al menos 1 h antes de la transferencia del inserto de cultivo de tejidos.
- Asegúrese de que cada bolsa estéril esté correctamente etiquetada (con la placa y la identificación del pocillo). Repita este paso para cada inserto de cultivo de tejidos. Excluya con cuidado las burbujas de aire al sellar las bolsas estériles (hágalo de forma segura girando la parte superior de las bolsas y aplicando una pinza de plástico).
- Vuelva a colocar las bolsas estériles con los insertos de cultivo de tejidos y las placas de 6 pocillos con medio experimental en la incubadora a 37 °C.
- Después de 1 h, empaque cuidadosamente las bolsas estériles con los insertos de cultivo de tejidos en cajas de plástico dentro de una caja termorregulada llena de agua desionizada a 37 °C para mantener las lonchas organotípicas a temperatura fisiológica durante todo el protocolo de exposición a ondas de choque.
>4. Preparación del tubo de choque y la exposición a la onda de choque organotípica del hipocampo
- Use botas protectoras con punta de acero, una bata de laboratorio y guantes mientras prepara el tubo de choque y expone la onda de choque.
- Atornille el marco del soporte de la bolsa estéril a la brida distal del tubo de choque, asegurándose de que el orificio central esté alineado con la salida del tubo de choque (usando una varilla ciega).
- Monte dos transductores de presión radialmente: el sensor 1 en la parte central de la sección impulsada y el sensor 2 en la brida distal del tubo de choque (Figura 1A). Conecte los transductores de presión a un osciloscopio a través de una unidad de alimentación de fuente de corriente.
- Asegúrese de que todas las válvulas de liberación del tubo de choque y los controles de flujo estén cerrados.
- Abra la línea de aire comprimido externa y cargue la electroválvula a 2,5 bar.
- Abra la válvula de seguridad del cilindro de aire comprimido y abra lentamente el regulador de presión para aumentar la presión a aproximadamente 5 bar.
NOTA: La presión ajustada para este regulador debe estar ligeramente por encima de la presión de ruptura del diafragma más alta.
- Prepare los diafragmas cortando láminas de poliéster de 23 μm de grosor en cuadrados de 10 x 10 cm2. Prepare los mangos con cinta adhesiva para autoclave y péguelos en la parte superior e inferior de cada diafragma.
- Coloque un diafragma (una ranura de la configuración de doble recámara - diafragma simple) o dos diafragmas (ambas ranuras de la configuración de doble recámara - doble diafragma) en la recámara (Figura 1B).
- Centre los diafragmas y sujételos con cuatro tornillos y tuercas M24, fijándolos secuencialmente en diagonal y asegurándose de que los diafragmas no se arruguen.
- Sujete cada bolsa estéril individualmente en posición vertical en el marco del soporte, asegurándose de que la superficie de los insertos de cultivo de tejidos con las rodajas organotípicas del hipocampo esté orientada hacia la salida del tubo de choque y el inserto de cultivo de tejidos esté centrado dentro de la bolsa estéril (Figura 1C). Asegúrese de que la bolsa estéril esté bien sujeta para garantizar una inmovilización firme y uniforme.
- Use protectores auditivos y gafas de seguridad cuando presione el tubo de choque. Encienda la fuente de corriente y el osciloscopio para adquirir los datos de la onda de choque (velocidad de adquisición de 50 mega muestras/s, longitud de registro de 20 ms, 1 millón de puntos) y cierre la electroválvula.
- Usando la perilla de control de flujo en el panel de control del tubo de choque, presurice lentamente la sección de volumen del controlador del tubo de choque para la configuración de un solo diafragma o tanto la sección de volumen del controlador como la sección de doble recámara del tubo de choque para la configuración de doble diafragma><.
nota: Para la configuración de un solo diafragma, la presión de ruptura dependerá solo del material y el grosor del diafragma, y el diafragma se romperá espontáneamente una vez que se alcance la presión de ruptura del material. Para la configuración de doble diafragma, la presión de ruptura también dependerá del diferencial de presión del gas tanto en el driver como en las cámaras de doble recámara, y para que los diafragmas revienten de forma controlada, la válvula de seguridad de doble recámara se abre manualmente una vez que se alcanzan las presiones objetivo.
- Tan pronto como el diafragma se rompa (produciendo un ruido fuerte), cierre rápidamente el flujo de aire comprimido con la perilla de flujo y abra la válvula solenoide.
nota: El volumen total de la sección del controlador se puede modificar mediante la inserción de segmentos de obturación, lo que permite obtener una gama más amplia de sobrepresiones y duraciones máximas de ondas de choque. La combinación ideal de parámetros de onda de choque debe ser suficiente para causar lesión en el tejido, pero no tan alta como para provocar la inserción del cultivo de tejido o la distorsión o ruptura de la bolsa estéril.
- Exponga cada bolsa estéril con cultivo de tejidos, insértela en una sola onda de tubo de choque y devuélvala inmediatamente a la caja termorregulada antes de sacar una nueva bolsa estéril de la caja y sujetarla en el marco del soporte. Asegúrese de que los pasos 4.10 a 4.14 se realicen de la manera más suave y rápida posible (en unos pocos minutos) para evitar que el medio experimental se enfríe, ya que las temperaturas inferiores a 37 °C pueden interferir con el desarrollo de lesiones.
- Una vez que todos los insertos de cultivo de tejidos hayan sido expuestos a una onda de choque (o protocolo simulado), devuélvalos a la placa original de 6 pocillos y a su respectivo pocillo (dentro de una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar) y devuélvalos a la incubadora.
- Mantenga la placa de 6 pocillos en la incubadora con un 5% de dióxido de carbono en el aire a 37 °C hasta obtener más imágenes.
- Incluya controles simulados para cada experimento y la exposición a la onda de choque del corte.
nota: Las lonchas simuladas se tratan de forma idéntica a las lonchas expuestas a una onda de choque (selladas en las bolsas estériles con medio experimental, transportadas al laboratorio de tubos de choque en la misma caja termorregulada y suspendidas en el marco metálico durante un período de tiempo equivalente), pero el tubo de choque no se dispara.
