Establecimiento de un modelo de enfermedad de Alzheimer en el cerebro de pez cebra mediante la inyección de péptido amiloide

Resumen

Bhattarai, P., et al. Modelando la toxicidad y neurodegeneración del amiloide-β42 en el cerebro del pez cebra adulto. J. Vis. Exp. (2017).

Este video muestra el procedimiento de inyectar péptidos amiloides monoméricos en el prosencéfalo de un pez cebra adulto para generar toxicidad amiloide, imitando el daño neuronal observado en la enfermedad de Alzheimer

Protocolo

>1. Preparación del péptido Aβ42

1. Sintetice péptidos (consulte la Tabla 1) utilizando la química estándar de 9-fluorenil metoxicarbonilo (Fmoc) con 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronoiohexafluorfosfato (HBTU) como reactivo de acoplamiento en un sintetizador de péptidos en fase sólida automatizado. La escala de síntesis fue de 100 μmol.
2. Cargue el sintetizador de péptidos automatizado con 500 mg de resina protegida con Fmoc como fase sólida (capacidad de carga de 0,2 mmol/g). Cargue los aminoácidos disueltos protegidos con Fmoc a una concentración de 0,5 M en el volumen requerido y según lo calculado para el sintetizador respectivo.
   nota: Los cálculos se realizan para permitir el acoplamiento de cada aminoácido protegido por Fmoc dos veces con 5 veces más de cada bloque de construcción a la resina.
3. Disuelva los reactivos necesarios para la síntesis de péptidos en dimetilformamida (DMF). Por ejemplo, prepare el activador, HBTU, a una concentración de 0,48 M, 45% v/v de N-metilmorfolina (NMM) (la base) y 5% v/v de anhídrido acético (la mezcla de taponamiento) para tapar los grupos amino no reaccionados.
4. Escindar todos los péptidos de la resina mezclando continuamente el soporte sólido con un agitador en una mezcla de escisión recién preparada que consiste en Ácido trifluoroacético (TFA): triisopropilsilano (TIS): agua: ditiotreitol (DTT) a 90 (v/v): 5 (v/v): 2,5 (v/v): 2,5 (m/v) durante 4 h. Utilice 10 mL para la escala de síntesis de 100 μmol.
5. Precipitar el producto escindido añadiendo la mezcla de escisión a 100 mL de éter dietílico helado. Pase a través de una unidad de filtración que contenga un filtro de politetrafluoroetileno (PTFE) con un tamaño de poro de 0,45 μm y lave con 20 ml de éter dietílico helado.
6. Recoja el péptido filtrado del papel de filtro y disuelva 100 mg de péptido precipitado en 5 mL de agua destilada desionizada: acetonitrilo a 1:1.
7. Purificar mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) en fase inversa en una HPLC semipreparativa equipada con una columna de poliestireno divinilbenceno poroso con un tamaño de perla de 10 μm.
   1. Precaliente la columna y manténgala a 50 °C con un dispositivo de calentamiento de columna. Recoja todas las fracciones principales utilizando un colector de fracciones automatizado aplicando un gradiente de 5% a 100% de solvente B durante 25 min a 4 mL/min.
      nota: El disolvente A es un 0,1% de TFA en agua, y el disolvente B es un 0,1% de TFA en acetonitrilo.
   2. Supervise el cromatograma a 220 nm, recopile los picos adecuados y analícelo mediante la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS).
8. Confirme la pureza mediante cromatografía líquida analítica de ultra alta presión (UPLC) de fase inversa a 220 nm, monitoreando con un detector ultravioleta (UV) mientras pasa la muestra a través de una columna analítica C18 (tamaño de perla 1,7 μm). Confirme el producto peptídico por espectrometría de masas.
   nota: El UPLC está acoplado a una espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS) y un detector de cuadrupolo en tándem.
9. Liofilizar las fracciones correctas del péptido deseado en un matraz de fondo redondo aplicando un vacío de 0,052 mbar a un polvo esponjoso. Acople la bomba de vacío a una unidad de congelación mantenida a -78 °C. Almacene a -80 °C indefinidamente.
10. Utilice el péptido liofilizado para preparar una solución madre de 1 mM en una mezcla de acetonitrilo, DMF y agua de grado analítico a 1:1:1 para los experimentos. Esta solución se puede almacenar durante al menos 6 meses, ya que los péptidos no se agregan en ella.

>2. Preparación de la mezcla de inyección

1. Prepare solución salina tamponada con fosfato (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH 7,4) para diluir los péptidos liofilizados.
2. Disuelva el péptido hasta una concentración final de 20 μM en PBS. Prepare esta solución fresca. Mezclar bien y almacenar en hielo hasta la inyección. No exceda los 30 minutos para evitar la agregación en la solución.

>3. Anestesia

1. Prepare la solución madre de los anestésicos, metanosulfonato de etil-m-aminobenzoato al 0,1% (MESAB), en agua de pescado normal del sistema circulante. Preparar la solución de anestesia hasta una concentración final de 0,0025% (v/v).
2. Retire el número deseado de peces de sus tanques y colóquelos en un contenedor de transporte con 5 L de agua del sistema.
3. Llene hasta la mitad una placa de Petri de plástico (90 mm) con 40 ml de anestésicos. Use este plato para inyecciones.
4. Incubar los peces en los anestésicos hasta que el movimiento opercular haya cesado.

4. Microinyección cerebroventricular

1. Preparación de aparatos de inyección
   1. Prepare los capilares de inyección de vidrio con un extractor de agujas con los siguientes parámetros: ciclo de calentamiento, 537; ciclo de extracción, 250; velocidad, 1,5 s; tiempo, 80 ms.
   2. Lleve el ajuste de presión en la fuente de presión a 25 psi.
   3. Establezca los parámetros del microinyector en 20 psi para retención y 10 psi para expulsión, 2,5 para período y 100 ms para compuerta.
   4. Cargue el capilar de vidrio con la solución inyectable. Inserte el capilar de vidrio en el soporte de microinyección. Ajuste el ángulo de inyección a 45°.
2. Coloque un pez en una nueva placa de Petri llena de solución anestésica.
3. Sujete el pez con las pinzas y oriéntelo para la inyección.
4. Genere una hendidura con la punta de una aguja de 30 G en el cráneo sobre el tectum óptico donde se unen las dos placas laterales. No inserte la punta en el tejido cerebral, esto causaría sangrado y daño.
5. Inserte el capilar de vidrio en la ranura.
   1. Utilice únicamente la punta de la aguja y no penetre más de 1 mm a través del cráneo. Siga sosteniendo el pez e inserte la punta del capilar de vidrio a través del sitio de la incisión.
   2. Oriente la punta del capilar de vidrio hacia el telencéfalo en un ángulo de 45°. Inyecte 1 μL de la solución. El líquido se dispersa inmediatamente después de la inyección.

5. Recuperación

1. Vuelva a colocar el pescado en un recipiente de transporte hasta que se recupere. Conecte el recipiente al agua de peces que circula regularmente para garantizar una calidad óptima del agua.
   nota: Normalmente, la recuperación debería tardar 1 minuto. Si lleva más tiempo, los peces deben mantenerse en los anestésicos durante menos tiempo (el experimentador necesita optimizar esto).

Resultados

Tabla 1: Secuencias peptídicas Aβ42 y TR-Aβ42.

...

péptido	Secuencia peptídica	MW (g/mol)
Aβ42	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA	4514.1
TR-Aβ42	GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aminoácidos protegidos contra Fmoc	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemania)		Aminoácidos a base de Fmoc para la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS)
N,N,N",N"-tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)hexafluorofosfato de uronio (HBTU)	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemania)	RL-1030	activador
Oxyma	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemania)	RL-1180	Supresor de racemización
N,N-diisopropiletilamina	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemania)	SOL-003	base
Dimetilformamida	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemania)	SOL-004	solvente
N-metilmorfolina	Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Alemania	A12158	base
Hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBT)	Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, EE. UU.)	157260 ALDRICH	activador
piperidina	MERCK KGaA (Darmstadt, Alemania)	822299	Reactivo de desprotección Fmoc
Diclormetano (DCM)	MERCK KGaA (Darmstadt, Alemania)	106050	solvente
Ácido fórmico (FA)	MERCK KGaA (Darmstadt, Alemania)	100264	Componente tampón para HPLC
Ácido trifluoroacético (TFA)	MERCK KGaA (Darmstadt, Alemania)	808260	Reactivo de mezcla Clevage
Triisopropilsilano (TIS)	MERCK KGaA (Darmstadt, Alemania)	233781 ALDRICH	Reactivo de mezcla Clevage
Acetonitrilo (para UPLC/LCMS)	Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH	34967-1L	solvente
Acetonitrilo (para HPLC)	VWR International Ltd, Inglaterra	83639.32	solvente
Dietilether	VWR International Ltd, Inglaterra	23811.326	Disolvente para la precipitación de péptidos
Ditiotritol (TDT)	VWR International Ltd, Inglaterra	0281-25G	Reactivo de mezcla Clevage
TentaGel S RAM Fmoc rink resina amida	Rapp Polymere GmbH (Tubinga, Alemania)	S30023	Fase sólida para SPPS
Síntesis de péptidos Jeringas de 5 ml con filtros incluidos	Intavis AG (Colonia, Alemania)	34.274	Tubo de reacción para SPPS y para clevage de la fase sólida
Filtro de politetrafluoroetileno (PTFE)	Sartorius Stedtim (Aubagne, Francia)	11806-50-N	Filtración de péptidos precipitados
Filtro de jeringa de fluoruro de polivinilideno (PVDF)	Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe	KC78.1	Prefiltrado para HPLC
Sintetizador de péptidos	Intavis, Colonia, Alemania	ResPep S.L	Sintetizador automatizado de péptidos en fase sólida
HPLC de la Alianza del Agua	Waters, Milford, Massachusetts, Estados Unidos	Aguas 2998, Aguas e2695	Cromatografía líquida de alta presión (HPLC) semipreparativa en fase inversa
PolymerX, tamaño del cordón 10μm, 250x10 mm	Phenomenex Ltd. Alemania	00G-4328-N0	Columna de HPLC de poliestireno divinilbenceno poroso
Milli-Q Advantage A10, con filtro Milli-Q	EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, EE. UU.	LCPAK0001	Sistema de purificación de agua
Unidad de filtración	Sartorius Stedtim (Aubagne, Francia)	Año 16307	Unidad de filtración para la precipitación de péptidos
Calidad UPLC con detector UV	Waters, Milford, Massachusetts, Estados Unidos	M09UPA 664M	Fase inversa analítica ultra HPLC para LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, tamaño del cordón 1,7 μm, 50x2,1 mm	Waters, Milford, Massachusetts, Estados Unidos	186002350	Columna analítica C18
Detector ACQUITY TQ	Waters, Milford, Massachusetts, Estados Unidos	QBB908	Espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6	Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Alemania	16706, 101542	Liofilizador con bomba de vacío
Lector de placas Paradigm	Beckman Coulter
MESAB (metanosulfonato de etil-m-aminobenzoato)	Sigma-Aldrich	A5040
Placas de Petri	Sarstedt	821.472
Solución salina tamponada con fosfato	Tecnologías de la Vida, GIBCO	10010-056
aguja	Becton-Dickinson	305178
Microscopio de disección	Olimpo, Leica, Zeiss	Varía según el fabricante
Pinzas Dumont	Instrumentos de precisión mundial	501985
Pinzas de disección Gillies	Instrumentos de precisión mundial	501265
Capilares de inyección de vidrio	Instrumentos de precisión mundial	TWF10
PicoNozzle	Instrumentos de precisión mundial	5430-12
PicoPump neumático	Instrumentos de precisión mundial	SYS-PV820
Iluminador de anillo; Guía de luz anular	Científico de Parkland	ILL-RLG

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