Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparar instrumentos quirúrgicos y soluciones para la cirugía
- Autoclave de todo el instrumental quirúrgico de acero inoxidable.
- Prepare etanol al 70% diluyendo etanol absoluto de 200 grados con agua destilada desionizada estéril de grado molecular.
- Coloque la aguja de 29 G en la jeringa Hamilton. Limpie el interior de la jeringa y la aguja Hamilton aspirando y expulsando agua nanopura repetidamente durante 1 min. Repita este procedimiento con etanol al 70%.
- Retire el émbolo y la aguja de la jeringa Hamilton. Secar al aire las piezas en una campana de flujo laminar O/N.
- Irradie la aguja y la jeringa con luz ultravioleta durante 30 minutos antes de usar.
- Prepare una solución salina disolviendo cloruro de sodio (NaCl) en agua de grado molecular hasta una concentración final de peso a volumen del 0,9%. Esterilice la solución filtrándola a través de un filtro de poros de 0,2 μm.
2. Preparar Beta-amiloide oligomérico (Aβ1-42)
- Monomerizar y resuspender el Aβ1-42 humano recombinante en dimetilsulfóxido (DMSO) a 5 mM exactamente como se describe en la publicación de Fa' y otros.
- Diluir 5 mM de Aβ1-42 con solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril (1x) hasta 100 μM el día antes de la cirugía.
- Mezclar bien la solución por trituración.
- Incubar la solución Aβ1-42 durante 12 horas a 4 °C.
nota: Las soluciones de control, como la dilución de DMSO en PBS o el péptido Aβ1-42 revuelto/inverso, deben prepararse de la misma manera que el Aβ1-42.
3. Determinar las coordenadas de inyección
- Utilice el atlas del cerebro de ratón adulto para determinar las coordenadas exactas antero-posterior (AP), medial-lateral (ML) y dorsal-ventral (DV) para la región del cerebro de interés.
nota: Para ilustrar la técnica, elegimos el giro dentado del hipocampo como objetivo con las siguientes coordenadas del bregma: AP, -2,00 mm; ML, ±1,3 mm; DV, -2,2 mm. El signo negativo que precede al valor de PA indica que es 2,00 mm posterior al brugma. El signo ± que precede al valor de ML indica la dirección izquierda y derecha desde el centro. Por último, el signo negativo que precede al DV indica que se está moviendo ventralmente desde la superficie del cerebro.
4. Configuración del marco estereotáxico
- Use una mascarilla quirúrgica, una bata de laboratorio limpia y guantes quirúrgicos estériles.
- Limpie el instrumento estereotáxico y el adaptador del ratón con etanol al 70%.
- Coloque un paño quirúrgico estéril sobre el mostrador.
- Coloque el instrumento estereotáxico con un adaptador de ratón sobre el paño quirúrgico estéril.
- Limpie la almohadilla térmica del mouse con etanol al 70%. Coloque la almohadilla térmica sobre la cama con marco estereotáxico. Utilice cinta adhesiva de laboratorio de uso general para pegar la almohadilla térmica sobre la cama del adaptador del ratón.
- Conecte la almohadilla térmica a la bomba de recirculación de agua caliente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Encienda la bomba de recirculación de agua caliente, ajuste la temperatura a 37 °C y espere hasta que alcance esa temperatura.
- Fije la jeringa Hamilton de 50 μl con una aguja de 29 G en el marco estereotáxico enroscándola en el eje de inyección vertical motorizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Encienda el esterilizador de perlas y espere hasta que alcance la temperatura preestablecida por el fabricante.
nota: Se utiliza para esterilizar instrumentos de acero inoxidable entre animales. Los instrumentos tardan 20 segundos en entrar en contacto con las perlas para su esterilización.
- Encienda la placa calefactora, ajústela a 42 °C y coloque encima una jaula limpia y vacía
.
- Mientras la jeringa Hamilton está fijada en el marco estereotáxico, utilice el inyector estereotáxico motorizado para extraer la solución Aβ1-42.
nota: Aspire más de 4 μl de la solución en la jeringa y, a continuación, utilice el inyector estereotáxico para ajustar el volumen de inyección. Opere el inyector de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5. Preparación de los animales
- Determine el peso del ratón utilizando la báscula.
- Anestesiar al ratón con cóctel de ketamina/xilacina a 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilacina inyectando por vía intraperitoneal (IP). Controle la profundidad de la anestesia mediante la pérdida del reflejo de pellizco del dedo del pie.
- Después de que el ratón esté sedado, tome el cortapelos y afeite su cabeza para exponer la piel sobre el cráneo.
- Coloque el mouse encima de la almohadilla térmica encima de la cama estereotáxica.
- Use la espátula para abrir la boca y coloque los dientes incisivos dentro del protector dental. Asegure la pieza nasal sobre la cara del ratón. Sujételo suavemente y no demasiado apretado.
- Coloque las barras transversales bilaterales de la oreja en el meato auditivo para asegurar la cabeza. Mueva cada travesaño hasta que golpee el cráneo y luego gire el tornillo para bloquearlo.
- Para asegurarse de que la cabeza esté asegurada, use su dedo índice para empujar suavemente la cabeza hacia abajo. Si la cabeza está bien asegurada, no cederá ni se moverá cuando se presione.
- Aplique una gota de crema para los ojos o un gota para los ojos para mantenerlos húmedos. Asegúrese de que los ojos estén húmedos durante todo el procedimiento quirúrgico.
- Para desinfectar el sitio quirúrgico, use hisopos de algodón estériles para aplicar una solución de betadine en la piel sobre el cráneo, seguida de etanol al 70%. Realice la limpieza alterna de betadine y etanol al 70% 2 veces más.
6. Cirugía e Infusión
- Use un bisturí para hacer una incisión de 2-3 mm en la línea media del cuero cabelludo y luego use unas tijeras finas rectas para extender la línea de incisión a 1,0-1,5 cm para exponer la sutura sagital, el bregma y la lambda del cráneo, puntos de referencia en los que se basan las coordenadas estereotáxicas. Use micro pinzas para mantener la piel separada.
nota: Las posiciones bregma y lambda se explican en el atlas del cerebro del ratón "El cerebro del ratón en coordenadas estereotáxicas".
- Tome un hisopo de algodón, sumérjalo en solución salina estéril y úselo para limpiar el cráneo. Luego, use un hisopo de algodón limpio y seco para secar el cráneo.
- Use un bolígrafo estéril de punta fina para marcar un punto en el bregma. Use el micromanipulador estereotáxico para colocar la jeringa Hamilton de modo que la punta de la aguja toque el punto del bregma.
- Registre la coordenada DV.
- Para comprobar si el eje AP del cráneo está nivelado, mueva la jeringa Hamilton hacia atrás para que la punta de la aguja toque el punto lambda.
- Registre la posición DV. Asegúrese de que las coordenadas DV para bregma y lambda estén dentro de 0,5 mm.
nota: El objetivo es minimizar la diferencia de DV entre bregma y lambda.
- Utilice el micromanipulador para devolver la punta de la aguja de la jeringa Hamilton al punto bregma.
- Registre la posición inicial del PA.
- Calcule la posición PA final restando 2,00 mm de la coordenada PA inicial.
- Utilice el micromanipulador para reposicionar la aguja de la jeringa Hamilton a la coordenada AP final.
- Registre la coordenada ML actual.
- Calcule las coordenadas ML finales izquierda y derecha sumando o restando 1,3 mm de la coordenada ML inicial.
- Utilice el micromanipulador para mover la aguja de la jeringa Hamilton a la coordenada ML final.
- Toque la punta de la aguja con la superficie del cráneo en ambas coordenadas ML finales y registre las coordenadas DV y asegúrese de que los valores estén dentro de 0,5 mm.
NOTA: El objetivo es minimizar la diferencia de DV entre las dos coordenadas ML finales.
- Mientras está en una coordenada final, tire de la aguja hacia arriba 0,5-1 cm sobre el cráneo. Tome un bolígrafo estéril de punta fina para marcar un punto en la superficie del cráneo. Repita este paso para el lado contralateral del cráneo.
- Aparta la jeringa Hamilton del camino.
- Fije la cabeza del taladro de 0,8 mm al taladro. Tome el taladro con ambas manos, coloque los codos en la superficie de la mesa para mayor estabilidad y coloque la cabeza del taladro ligeramente por encima del punto sharpie en la coordenada ML izquierda o derecha. Active el taladro, baje la punta del taladro sobre la superficie del cráneo para introducir un orificio en el cráneo. Repita este paso para el lado contralateral.
nota: Es posible que se produzca algo de sangrado por los orificios recién introducidos. Si hay sangrado, use un hisopo de algodón limpio y seco para frotar la sangre.
- Vuelva a colocar la jeringa Hamilton en su posición sobre cualquiera de los orificios ML recién introducidos. Baja la aguja de Hamilton justo después del cráneo. En este punto, tenga cuidado de no perforar el cerebro. Para asegurarse de que la aguja haya pasado por el cráneo, tome su dedo índice y empuje suavemente la aguja contra el cráneo para asegurarse de que la aguja no salga del orificio.
- Registre la coordenada DV de inicio.
- Calcule la coordenada DV final restando 2,2 mm de la coordenada DV inicial.
- Baje la aguja hasta la coordenada DV final.
- Active la bomba inyectora estereotáxica para bombear 4 μl de Aβ1-42 en el giro dentado a una velocidad de 0,5 μl/min.
- Cuando se complete la infusión, deje que la aguja permanezca en su lugar durante 1 minuto adicional para minimizar el reflujo de la solución fuera del lugar de la inyección.
- Mueva la aguja al otro lado del cerebro y repita los pasos 6.13 a 6.18.
7. Retirada de animales y cuidados postoperatorios
- Desatornille las barras para los oídos y el protector de la cara/nariz. Retire el ratón del aparato.
- Use unas pinzas de patrón estándar de estudiante para cerrar el cuero cabelludo y luego selle la herida con una sutura.
