Las neuronas se caracterizan primera electrofisiológica. A continuación, el citoplasma de las neuronas registradas se aspira y se somete a la transcripción reversa-PCR y análisis para detectar la expresión de ARNm para enzimas síntesis de neurotransmisores, canales iónicos y receptores.
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Artículo de método
Perfiles de voltaje de expresión del ARNm de potasio en las neuronas Canal nigral con una sola celda de RT-PCR Técnicas
En este artículo
Resumen
Resumen
En los mamíferos el sistema nervioso central, los diferentes tipos de neuronas con diversas características moleculares y funcionales se entremezclan entre sí difíciles otro, para separar y no se identifica fácilmente por su morfología. Por lo tanto, es a menudo difícil de analizar la expresión génica en un tipo de neurona específica. Aquí se documenta un procedimiento que combina células enteras patch clamp técnicas de grabación con una sola célula reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (SCRT-PCR) para el perfil de expresión de ARNm en los diferentes tipos de neuronas en el nigra sustancial. Técnicas electrofisiológicas se utilizó por primera vez para registrar las propiedades neurofisiológicas y funcional de las neuronas individuales. Entonces, el citoplasma de las neuronas individuales electrofisiológicamente caracteriza nigral se aspira y se somete a SCRT-PCR análisis para obtener los perfiles de expresión de ARNm de enzimas síntesis de neurotransmisores, receptores y canales iónicos. La alta selectividad y la sensibilidad que este método sea especialmente útil cuando la inmunohistoquímica no se pueden utilizar debido a la falta de anticuerpos adecuado o bajo nivel de expresión de la proteína. Este método también es aplicable a las neuronas de otras áreas del cerebro.
Protocolo
1. Cerebro rebanada preparación
- Jóvenes (15-40 días) hombres y mujeres ratas Sprague-Dawley se utilizan. (También utilizamos este mismo protocolo en ratones.) Bajo anestesia profunda de uretano, los animales se decapitan y el cerebro es rápidamente disecados. De 300 micras de grosor del cerebro que contiene la parte coronal midrostral de la sustancia negra se cortan en un vibratome Leica (VT-1200S). El corte de corte procedimiento se realiza en un helado, sacarosa oxigenada de corte de alta solución que contiene (en mM): 220 sacarosa, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 de NaHCO3, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 10 D- ....
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Discusión
La combinación de la grabación de patch clamp en cortes de cerebro con SCRT-PCR hemos demostrado aquí proporcionan un excelente método para investigar los perfiles de expresión de mRNA de los canales iónicos, receptores y las enzimas clave para la síntesis de neurotransmisores en las neuronas caracteriza individualmente. Esto es particularmente útil cuando la proteína en cuestión no puede ser detectado y localizado por otros métodos como la inmunohistoquímica debido al bajo nivel de expresión y / o la falta de anticuerp.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH R01DA021194 y R01NS058850.
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Materiales
Tabla 1. Reactivos y equipos clave
Tabla 2. Primer pares de rata neuronal KV3 canal, la tirosina hidroxilasa (TH) y el ácido glutámico decarboxilasa 1 (GAD1) mRNAs para SCRT-PCR
Referencias
- J, Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription. EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).
- Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny ne....
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Reimpresiones y permisos
